肺炎链球菌x基因可影响细菌毒力基因表达

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1、肺炎链球菌X基因可影响细菌毒力基因表达作者：张雪梅，尹一兵，孟江萍，许颂霄，王虹，黄远帅【摘要】目的：探讨肺炎链球菌的转化相关基因X与其毒力表达的关系.方法：采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株，通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化，并应用RTPCR测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶（phd），分泌型IgA结合蛋白（sIgA），肺炎链球菌自溶酶（lytA），肺炎链球菌神经氨酸酶A（nanA）和肺炎链球菌溶血素（ply）在细菌感受态发生过程中的表达，并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同.结果：野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子（CSP）诱导表达增加

2、；虽X基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异，但其ply基因的表达与E基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达.结论：X可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达.【关键词】链球菌，肺炎；自转化，细菌；毒力基因0引言　　肺炎链球菌是目前发现转化效率最高的一种细菌，一些可被感受态刺激蛋白（CSP）诱导表达的蛋白基因变异时，肺炎链球菌的毒力减弱［1-2］.我们已发现调控肺炎链球菌转化的一个关键基因E基因缺陷后，其毒力会减弱［3］.　　　　近来发现了一个新基因X与肺炎链球菌转化相关，其编码的蛋白具有δ因子的作用，可诱导一系列转化相关的晚期基因如cinArecA,c

3、ilABCDE,coiA和cfl等的表达，使细菌发生转化［4-5］.我们拟通过构建相关基因的缺陷菌株，比较其与野生菌株的毒力因子表达，以探讨基因X是否与细菌毒力表达相关及相关的分子机制.　　1材料和方法　　1.1材料试验菌株及动物2型光滑型(SⅡ型)肺炎链球菌：中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏中心提供，主要遗传特征经鉴定合格.健康BALB/c小鼠38只，由第三军医大学动物中心提供.体质量18~22g，随机分为三组，野生菌株组（的E断裂基因)、肺炎链球菌CPM10的染色体DNA(含有标志基因红霉素抗性基因erm的X1断裂基因和标志基因四环素抗性基因tet的X2

4、断裂基因),CSP，由美国Morrison教授提供.引物序列由上海生物工程技术有限公司合成(表1)，毒力因子序列由日本遗传子研究所设计并合成(表2).　　表1扩增各基因的引物序列（略）　　表2毒力基因所用的引物（略）　　注：phd为透明质酸酶,sIgA为分泌型IgA结合蛋白,lytA为肺炎球菌自溶酶,nanA为肺炎球菌神经氨酸酶A,ply为肺炎球菌溶血素.　　1.2方法　　1.2.1肺炎链球菌E,X1,X2和X全基因缺陷菌株的制备以菌株CPM17的染色体DNA为模板，PCR扩增出E断裂基因（EupermEdX1dmol/L的CaCl2和2g/L牛血清白蛋白）中

5、至A550nm=0.1左右，加入感受态刺激因子（CSP）20μg/L，然后分别加入E,X1,X2断裂基因的PCR产物各1g/L于不同的试管中，37℃孵育90min，然后分别铺于含红霉素（0.25mg/L）,四环素（0.25mg/L）和二者都含的血平板（TSA）上，于37℃孵箱培养24～48h，挑取菌落于C+Y培养基中培养，当细菌密度为A620nm=0.2左右时，冻于-70℃冰箱保存，此即为转化菌落.　　1.2.2E,X1,X2和X全基因缺陷菌株的鉴定将野生菌与缺陷菌同时做转化实验，选用CP1250的DNA为外源基因;提取野生菌与缺陷菌的染色体DNA，分别以erm和t

6、et的引物［5］进行PCR扩增.　　1.2.3小鼠腹腔感染毒力试验［6］将过夜培养于C+Y培养基中的肺炎链球菌稀释20倍于C+Y培养基中培养6h，到其A620nm>0.6,然后用无菌PBS稀释成适当的浓度.经过浓度梯度感染预实验，将菌株稀释成5×105cfu/L，分别在Balb/c小鼠腹腔内注入0.1mL菌液，记录小鼠死亡时间，可得到各菌株的半数致死时间.　　1.2.4半定量RTPCR测定毒力基因的表达　　1.2.4.1总RNA的提取：将野生型肺炎链球菌及其各基因缺陷菌株（E-,X-,X1-和X2-）分别培养于CTM培养基中，在A550nm分别为0.1左右时

7、各加入CSP至100μg/L，诱导感受态发生.分别在加入CSP的0,10,20min三个时相取1mL菌液，冻于-70℃冰箱，用以RNA提取.将所取的样本按Qiagen试剂盒的总RNA提取法提取总RNA.　　1.2.4.2半定量RTPCR以cDNA为模板［3］，以基因16SrRNA（为内参）和五种毒力基因的引物（序列见表2），分别PCR扩增相应片段.循环参数为：94℃1min,55℃40s,72℃45s，30个循环，琼脂糖电泳（Marker:ФX174DNA/HinfⅠ），照相.　　统计学处理：小鼠毒力实验得到的各菌株半数致死时间结果用mannRNA表达图谱通