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1、肺炎链球菌X基因可影响细菌毒力基因表达作者:张雪梅,尹一兵,孟江萍,许颂霄,王虹,黄远帅【摘要】目的:探讨肺炎链球菌的转化相关基因X与其毒力表达的关系.方法:采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株,通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化,并应用RTPCR测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶(phd),分泌型IgA结合蛋白(sIgA),肺炎链球菌自溶酶(lytA),肺炎链球菌神经氨酸酶A(nanA)和肺炎链球菌溶血素(ply)在细菌感受态发生过程中的表达,并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同.结果:野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子(CSP)诱导表达增加
2、;虽X基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异,但其ply基因的表达与E基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达.结论:X可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达.【关键词】链球菌,肺炎;自转化,细菌;毒力基因0引言 肺炎链球菌是目前发现转化效率最高的一种细菌,一些可被感受态刺激蛋白(CSP)诱导表达的蛋白基因变异时,肺炎链球菌的毒力减弱[1-2].我们已发现调控肺炎链球菌转化的一个关键基因E基因缺陷后,其毒力会减弱[3]. 近来发现了一个新基因X与肺炎链球菌转化相关,其编码的蛋白具有δ因子的作用,可诱导一系列转化相关的晚期基因如cinArecA,c
3、ilABCDE,coiA和cfl等的表达,使细菌发生转化[4-5].我们拟通过构建相关基因的缺陷菌株,比较其与野生菌株的毒力因子表达,以探讨基因X是否与细菌毒力表达相关及相关的分子机制. 1材料和方法 1.1材料试验菌株及动物2型光滑型(SⅡ型)肺炎链球菌:中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏中心提供,主要遗传特征经鉴定合格.健康BALB/c小鼠38只,由第三军医大学动物中心提供.体质量18~22g,随机分为三组,野生菌株组(的E断裂基因)、肺炎链球菌CPM10的染色体DNA(含有标志基因红霉素抗性基因erm的X1断裂基因和标志基因四环素抗性基因tet的X2
4、断裂基因),CSP,由美国Morrison教授提供.引物序列由上海生物工程技术有限公司合成(表1),毒力因子序列由日本遗传子研究所设计并合成(表2). 表1扩增各基因的引物序列(略) 表2毒力基因所用的引物(略) 注:phd为透明质酸酶,sIgA为分泌型IgA结合蛋白,lytA为肺炎球菌自溶酶,nanA为肺炎球菌神经氨酸酶A,ply为肺炎球菌溶血素. 1.2方法 1.2.1肺炎链球菌E,X1,X2和X全基因缺陷菌株的制备以菌株CPM17的染色体DNA为模板,PCR扩增出E断裂基因(EupermEdX1dmol/L的CaCl2和2g/L牛血清白蛋白)中
5、至A550nm=0.1左右,加入感受态刺激因子(CSP)20μg/L,然后分别加入E,X1,X2断裂基因的PCR产物各1g/L于不同的试管中,37℃孵育90min,然后分别铺于含红霉素(0.25mg/L),四环素(0.25mg/L)和二者都含的血平板(TSA)上,于37℃孵箱培养24~48h,挑取菌落于C+Y培养基中培养,当细菌密度为A620nm=0.2左右时,冻于-70℃冰箱保存,此即为转化菌落. 1.2.2E,X1,X2和X全基因缺陷菌株的鉴定将野生菌与缺陷菌同时做转化实验,选用CP1250的DNA为外源基因;提取野生菌与缺陷菌的染色体DNA,分别以erm和t
6、et的引物[5]进行PCR扩增. 1.2.3小鼠腹腔感染毒力试验[6]将过夜培养于C+Y培养基中的肺炎链球菌稀释20倍于C+Y培养基中培养6h,到其A620nm>0.6,然后用无菌PBS稀释成适当的浓度.经过浓度梯度感染预实验,将菌株稀释成5×105cfu/L,分别在Balb/c小鼠腹腔内注入0.1mL菌液,记录小鼠死亡时间,可得到各菌株的半数致死时间. 1.2.4半定量RTPCR测定毒力基因的表达 1.2.4.1总RNA的提取:将野生型肺炎链球菌及其各基因缺陷菌株(E-,X-,X1-和X2-)分别培养于CTM培养基中,在A550nm分别为0.1左右时
7、各加入CSP至100μg/L,诱导感受态发生.分别在加入CSP的0,10,20min三个时相取1mL菌液,冻于-70℃冰箱,用以RNA提取.将所取的样本按Qiagen试剂盒的总RNA提取法提取总RNA. 1.2.4.2半定量RTPCR以cDNA为模板[3],以基因16SrRNA(为内参)和五种毒力基因的引物(序列见表2),分别PCR扩增相应片段.循环参数为:94℃1min,55℃40s,72℃45s,30个循环,琼脂糖电泳(Marker:ФX174DNA/HinfⅠ),照相. 统计学处理:小鼠毒力实验得到的各菌株半数致死时间结果用mannRNA表达图谱通