htra基因缺陷对肺炎链球菌毒力影响的研究论文

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1、HtrA基因缺陷对肺炎链球菌毒力影响的研究论文黄远帅，许颂霄，朱旦，阳强，刘明芳，陈淑惠，张雪梅，尹一兵【关键词】肺炎链球菌；毒力因子；密度感应系统；HtrA基因EffectofHtrAgenedeletiononvirulenceofStreptococcuspneumoniae【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectofHtrAgenedeletiononthevirulenceofStreptococcuspneumoniae.METHODS:HtrAdeficientstra

2、ineasuretheexpressionlevelsofvirulentfactorsandstudythevirulencechangebymicevirulenceexperiments.RESULTS:TheexpressionofvirulentfactorsinHtrAdeficientstrainationcapabilityofHtrAdeficientstrainobviouslydecreased.Micevirulenceexperimentsshoedianlethaltimeoftheut

3、antinationofHtrAmutantinmicebloodationcapability,oniae;virulencefactor;quorumsensing;HtrAgene【摘要】目的：HtrA基因可编码肺炎链球菌的一种重要蛋白酶.freeloniae,S.pn）是世界范围内引起感染和死亡的重要病原菌之一，是引起肺炎、脑膜炎和中耳炎最常见的病原菌［1］.目前广泛使用的23价肺炎链球菌多糖疫苗免疫原性弱，对老人、幼儿和免疫缺陷疾病患者预防保护效果较差［2］.以破伤风和白喉类毒素作载体的11价S.pn结合

4、疫苗仅对2岁以下的婴幼儿有较好的免疫原性［3］.最新研制的S.pn溶血素等蛋白类疫苗也只是处于早期临床试验阶段［4-5］.要彻底解决S.pn感染的防治关键在于进一步阐明肺炎链球菌致病的分子机制.HtrA(hightemperaturerequirementA)是S.pn的一种热休克诱导的丝氨酸蛋白酶，又叫做DegP或DO蛋白酶［6］.HtrA同时具有一般的分子伴侣功能和蛋白水解活性，环境温度升高时其蛋白酶活性变得明显［7］.目前，已经在多种生物中发现了HtrA的相似体，比如细菌、酵母、植物［8］和人类［9］.在这些

5、生物中HtrA的作用大多表现为帮助它们逃避高氧浓度、高温和高渗等环境变化.HtrA存在于多种革兰氏阴性和阳性细菌中，1998年Gasc等［10］于S.pn中首次发现HtrA，并被CiaRH双成分系统(ts，TCS)调控［11］.HtrA在一次使用信号标签诱变技术（signaturetaggedmutagenesis）的筛选中被认为是S.pn的毒力因子［12］.2002年Sebert等［13］通过S.pn的幼鼠感染模型进行转录谱基因芯片筛选发现，HtrA可能参与S.pn于鼻咽部的定植.但HtrA做为S.pn的毒力因子

6、的具体机制目前尚不清楚.为深入探讨HtrA作用机制，我们拟构建HtrA基因的缺陷株，研究缺陷株S.pn毒力的变化，并从S.pn毒力基因的表达、于小鼠体内存活情况和转化能力改变3方面来分析HtrA在S.pn毒力中的作用.1材料和方法1.1材料S.pn血清TIGR4型购自美国标准菌库（ATCC），细菌经鉴定合格：Optochin试验阴性，胆汁溶菌试验阳性，血培养呈光滑、半透明、扁平小菌落伴草绿色α溶血环.S.pn培养用C+Y半合成培养基，含5g/L酵母抽提物［14］.质粒筛选用氯霉素LB平板及氯霉素LB液体培养基.血培

7、养用TSA血平板（含50mL/L脱纤维全血）.含氯霉素TSA血平板筛选整合有质粒染色体的缺陷菌.转化试验用含红霉素TSA血平板.S.pnCPM8染色体DNA（含有红霉素抗性基因erm）、感受态刺激肽（petencestimulatingpeptide,CSP）和质粒pEVP3由美国MorrisonDA教授惠赠.逆转录酶MMVL及其试剂购自Promega公司.胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，PCR试剂购自上海生物工程技术服务有限公司，琼脂糖购自BBI公司，DNA分子量标准（SM0261）购自MBI公司，RNA

8、提取试剂盒为RNeasyMiniKits，购自德国Qiagen公司，随机引物由上海博亚生物技术有限公司合成，其他引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1.表1各基因引物序列（略）1.2方法1.2.1HtrA缺陷菌株的构建重组质粒的构建：以TIGR4的DNA为模板，PCR扩增HtrA.循环条件：94℃30s，55℃30s，72℃30s，30次循环；