licd2基因缺陷导致肺炎链球菌毒力下降论文

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1、licD2基因缺陷导致肺炎链球菌毒力下降论文蓝锴，单幼兰，袁军，孟江萍，张雪梅，尹一兵【关键词】缺陷DeletionoflicD2geneleadstoreducedvirulenceofStreptococcuspneumoniae【Abstract】AIM:ToassesstheroleoflicD2geneinthevirulenceofStreptococcuspneumoniae.METHODS:licD2deficientstraineasuretheexpressionlevelsofvirulentfactorsandthevirulenceices

2、urvivaltest.RESULTS:TheexpressionofvirulentfactorsinlicD2deficientstrainationcapabilityoflicD2deficientdecreasedobviously,evenpletelylost.Micevirulenceexperimentsshoeofutationorethan2inationspeedoflicD2mutationinmicebloodationcapabilityandtheexpressionofvirulentgenes,thusmarkedlyreduci

3、ngthebacterialvirulence.【Keyoniae;virulence;reversetranscriptasepolymerasechainreaction【摘要】目的：licD2是掌控肺炎链球菌生长所需物质胆碱代谢最重要的基因.本研究探索licD2基因的缺陷是否影响细菌毒力.方法：采用插入复制失活的方法缺陷licD2基因，通过相对定量RTPCR分析其毒力因子表达情况，并利用动物体内试验观察licD2基因缺陷菌株毒力改变.结果：RTPCR显示licD2缺陷菌株毒力因子表达低于野生菌.freeloniae,S.pn）多糖疫苗，虽然效果较好，但是该疫苗

4、不是蛋白类疫苗、免疫原性较弱，对免疫力低下的人群如老年人、幼儿等预防效果较差［1］.最新研制出以破伤风和白喉类毒素作载体的11价S.pn结合疫苗对婴幼儿有很好的免疫原性，但也仅仅限于2岁以下的幼儿［2］.因此要彻底解决S.pn感染的防治，仍需深入理解肺炎链球菌致病的分子机制.胆碱作为S.pn所需的生长因子，在链球菌细胞分裂、转化和自溶等生物学特性中有着不可替代的作用.链球菌表面的磷脂酰胆碱可直接与宿主细胞表面作用，从而促进黏附和侵袭［3］.磷脂酰胆碱还是大量内皮和上皮细胞表面血小板活化因子受体（plateletactivatingfactorreceptor,PAF

5、R）的黏附配体，S.pn利用胆碱与此受体结合后对宿主细胞的黏附和侵袭会明显增加［4］.磷脂酰胆碱还是将胆碱结合蛋白（cholinebindingproteins,CBPs）这一大类毒力因子家族锚定于细菌表面不可缺少的“锚”［5］.近来发现细胞表面磷脂酰胆碱抗原决定簇的表达需要lic1位点，包含有4个基因，即：licA,licB,licC和licD.在众多的基因位点中，仅有licD2缺陷后S.pn的多种生物学显型，如胆碱摄取能力、转化力、青霉素诱导自溶等才发生显著变化［6］,但具体的机制尚不清楚.我们拟构建licD2基因的缺陷株，研究该基因缺陷后细菌毒力的变化，并从细

6、菌毒力基因的表达、细菌在体内存活情况等方面探讨分析导致细菌毒力下降的原因.1材料和方法1.1材料S.pn血清3型（CMCC31203）购自中国医学微生物菌种保藏中心，主要特征经鉴定合格：血培养呈光滑、半透明、扁平小菌落伴草绿色溶血环、胆汁溶菌试验阳性、Optochin试验阴性.S.pn液体培养基为C+Y半合成培养基，含5g/L酵母抽提物（LacksandHotchkiss,1960）.质粒筛选用氯霉素LB平板，及氯霉素LB液体培养基.血培养用TSA血平板，含50mL/L兔脱纤维全血.含氯霉素TSA血平板筛选整合有质粒染色体的缺陷菌.转化试验用含红霉素TSA血平板.S

7、.pnCPM8染色体DNA（含有红霉素抗性基因erm）、感受态刺激肽（petencestimulatingpeptide,CSP），质粒pEVP3由美国MorrisonDA教授惠赠.胶回收试剂盒（大连宝生物工程有限公司），PCR试剂（上海生物工程技术服务有限公司），琼脂糖（BBI公司），Marker（MBI公司），RNA提取试剂盒为RNeasyMiniKits（德国Qiagen公司），随机引物，上海博亚生物技术有限公司合成（其他引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1）.逆转录酶MMVL及其试剂（Promega公司）.表1各基因引物序列（略）1.2方