舒洛地特对糖尿病大鼠肾脏转化生子因子β1与结缔组织生长因子表达的影响

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1、舒洛地特对糖尿病大鼠肾脏转化生子因子β1与结缔组织生长因子表达的影响【摘要】目的探讨舒洛地特对糖尿病大鼠肾组织转化生长因子β1(TGFβ1)、结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法将SD雄性大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立早期糖尿病肾病(DN)模型，成模20只，随机分为DN组、糖尿病肾病治疗组(DNS组)，各10只，另有10只为对照组。DNS组予以舒洛地特(10mg·kg-1·d-1)肌肉注射。8a)；放射免疫法测试大鼠尿微量白蛋白试剂盒(ADL公司)；日立7600生化分析仪；兔抗TGFβ1、C

2、TGF抗体(武汉博士德生物有限公司)；抗体稀释液(Dako公司)；EnVision免疫组化试剂盒(广州基因有限公司)；BCA试剂盒(美国Pierce)。　　1.2模型建立和分组　　健康清洁级雄性SD大鼠35只，体重(200±20)g〔由沈阳军区总医院实验动物中心提供，使用许可证：SYXK(军200701T)〕。适应性喂养1g/kg1次腹腔注射。72h后大鼠眼眶采血测定空腹血糖。血糖＞16.7mmol/L为造模成功，共有20只成功，随机分为DN组和DN舒洛地特治疗组(DNS组)，各10只。DNS组给予舒洛地特

3、10mg/kg肌肉注射每日1次，共8l放入EP管中，以3000r/min离心5min后，将血清移入另一EP管中，采用日立7600生化分析仪检测血糖、血肌酐、血尿素氮。　　1.5计算肾脏肥大指数　　大鼠处死前称体重(BP2000图像分析系统，对图像进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。肾小球免疫组化TGFβ1、CTGF阳性面积测定：在光学显微镜计算机图像分析系统屏幕上，每例标本400倍镜下随机观察5个肾小球，分别计算每个肾小球TGFβ1、CTGF的阳性面积比值，即阳性面积/肾小球面积，取其平均

4、值进行统计学分析。　　1.8SF100μg/μl，aprotinin1μg/ml，leupeptin1μg/ml)中裂解，匀浆后冰浴30min，然后离心20min，提取组织蛋白，BCA法测蛋白浓度。取蛋白质上样100μg，进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转移至聚氟乙烯膜上，封闭液封闭，加入1∶200稀释的TGFβ1抗体，4℃过夜。0.05％TBST洗膜3次，ECL显影。以βactin的蛋白表达为参照。用ScionImage分析软件测定各条带灰度值，取其均值进行统计学分析。肾脏CTGF分析方法及过程同

5、TGFβ1。　　1.9统计学处理　　计量资料采用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件。组间数据比较采用单因素方差分析。(方差齐时用LSD法、方差不齐时用Tamhane法)。　　2.3体重、K的合成〔3〕。CTGF作为TGFβ1的下游因子，在DN时过表达，目前认为是DN发生的重要驱动因子之一。FN、Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原是ECM的主要成分。CTGF可以上调系膜细胞中FN、Ⅰ型及Ⅳ型胶原蛋白等的表达，此过程是TGFβ依赖和非依赖的。CTGF不仅促进ECM合成的增加和沉积，而且还影响ECM的降解。　　McL

6、ennan等〔4〕研究表明CTGF可通过上调基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP1)等生成，直接影响ECM的降解，也可与TIMP1联合介导高糖和TGFβ对ECM降解的下调。本研究表明，8inoglycans,GAG)是由各种硫酸二糖直链组成的天然多糖衍生物，与核心蛋白通过共价键连接形成复合大分子物质蛋白聚糖，广泛分布于人体及动物内的各个器官。GAG作为体内蛋白聚糖的糖链成分，是ECM和细胞膜的主要组成成分，可以维持膜的选择通透性，在体内对肾脏的滤过功能有调节作用，减少尿蛋白的排泄。鉴于GAG可以减少尿蛋白

7、，对肾脏有保护作用，国外在细胞分子水平研究了GAG对实验性糖尿病动物的肾脏保护机制，但确切机制尚未明了，仅提出几种假说，例如下调蛋白酶活性、抑制乙酰肝素酶、调节血管紧张素Ⅱ介导的细胞信号传递、恢复肾小球基底膜的负电荷〔5～7〕。目前，人们已经从动物小肠提取分离、沉淀一种天然的血管壁GAG-舒洛地特。舒洛地特作为一种特异性的GAG，由80%的硫酸艾杜糖葡糖胺聚糖(IGS)和20%的硫酸皮肤素(DS)组成。动物实验及临床药理学研究证实，使用舒洛地特可以为内皮细胞提供有效的GAG。为了进一步探讨舒洛地特的肾脏保护机

8、制，我们进行了本研究，结果发现舒洛地特能够降低糖尿病大鼠早期尿白蛋白排泄，同时经舒洛地特治疗的糖尿病大鼠肾脏肥大指数、肾小球面积及ECM面积明显减小，说明舒洛地特可以抑制早期肾脏肥大，减轻肾脏病理变化；DNS组大鼠肾皮质TGFβ1、CTGF蛋白表达明显减少，提示舒洛地特可以抑制TGFβ1、CTGF在肾脏的过表达，从而抑制ECM的过度积聚，对肾脏起到保护作用。本实验证实了舒洛地特的肾脏保护作用与抑