电针对糖尿病大鼠学习记忆及海马结缔组织生长因子表达的影响

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1、电针对糖尿病大鼠学习记忆及海马结缔组织生长因子表达的影响:马萍,纪中,于航,楚玉荣【摘要】目的观察电针对糖尿病性认知功能障碍大鼠学习记忆的改善作用及其对海马结缔组织生长因子(connectivetissuegroRNA和蛋白表达的影响。方法采用腹腔注射20g/L链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)构建糖尿病大鼠模型,将模型大鼠随机分为电针组(EA)、模型组(DM)、正常组()。电针4周后测定大鼠血糖水平,应用Morris水迷宫法观察电针对糖尿病大鼠学习记忆的影响,并用RTPCR和免疫组化方法检测海马CTGFmRNA和蛋白表达水平。结果模型组血

2、糖、上台潜伏期高于正常组和电针组(P<0.01),模型组CTGMmRNA和蛋白表达明显低于正常组和电针组(P<0.01)。结论电针能在一定程度上降低血糖,促进海马CTGFmRNA和蛋白表达,改善糖尿病认知功能障碍者的学习记忆和认知功能。【关键词】电针;血糖;学习记忆;海马;结缔组织生长因子ABSTRACT:ObjectiveToobservetheeffectofelectroacupunctureonimprovementoflearningandmemoryabilityandtheexpressionofconnectivetissuegr

3、oRNAandproteininhippocampusindiabeticratspairment.MethodsTheratdiabetesmodellydividedintothreegroups:electroacupuncturegroup(EA),diabetesmellitusuntreatedgroup(DM)andcontrolgroup().Afterfourent,bloodglucoselevelinedandtheeffectofelectroacupunctureonlearningandmemoryinedaze.RTPC

4、RRNAlevel,andimmunohistochemistryRNAandtheproteininDMprovethelearningandmemoryabilityindiabeticratspairment.KEY)13只和电针组(EA)13只,治疗过程中模型组有4只大鼠死亡,电针组有3只大鼠死亡。电针取穴参照《实验针灸学》[1],大鼠百会穴在顶骨正中,大椎穴在第7颈椎与第1胸椎棘突之间,背部膀胱经第1侧线位于脊柱正中旁开5mm。用30号1寸毫针,沿皮斜刺百会、大椎穴,刺入0.5寸,接G6805型电针仪,通以疏密波,频率14~26次/min,强度以大

5、鼠耳廓轻微颤动为度(约30mA)。每次电针15min,隔日1次,连续4周。1.2.2Morris水迷宫实验白色圆形水池直径为120cm,高60cm,平台高40cm,平台直径10cm。水池等分4个象限,任一象限放置平台。水深42cm,加入奶粉使水显乳白色。大鼠每天上、下午各训练1次,连续2周。90s仍未找到平台者,则将其放置于平台上站立10s。第2周到第4周每间隔1d后上午将大鼠从平台正对的象限入水,测定每只大鼠学习能力。观察指标为:观察90s内找到平台的时间(上台潜伏期)。1.2.3免疫组化及RTPCR实验4周末乙醚麻醉下眶后静脉采血,待查血糖。处死动物,

6、开颅取出脑,用等渗生理盐水清洗去水后迅速将大脑海马组织放入液氮中速冻,置―70℃冰箱中保存备用。选取5μm厚海马冠状切片,CTGF免疫组织化学染色(ABC法)。石蜡切片脱蜡、水化,PBS冲洗,30mL/LH2O2以阻断内源性过氧化物酶活性,一抗用兔抗鼠的CTGF(1∶100),二抗用羊抗兔IgG(1∶200),DAB显色,苏木精复染,脱水、透明,封片。每个标本随机取6张切片,每张切片随机选6个区域,每个区域面积为200μm,计数每个区域阳性细胞数,取平均值统计数据。取速冻大鼠海马约100mg,按Trizol试剂说明书方法提取总RNA。取1μg进行RTPCR

7、反应。PCRCTGF引物序列[2]分别为上游5′CTAAGACCTGTGGAATGGGC3′;下游5′CTCAAAGATGTCATTGCCCCC3′(扩增片段长383bp)。同时扩增βactin[2],其引物序列分别为上游5′GTGGGCGCTCTAGGCACCAA3′;下游5′CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC3′(扩增片段长540bp)。PCR变性、退火和延伸温度分别为94℃、55℃和72℃,反应时间分别为45s、45s和60s,共进行30个循环。循环完毕再72℃延伸10min。PCR产物用20g/L琼脂凝胶电泳分析,电泳

8、后在紫外灯下拍照,用TanonGIS1000凝胶成

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1、电针对糖尿病大鼠学习记忆及海马结缔组织生长因子表达的影响:马萍,纪中,于航,楚玉荣【摘要】目的观察电针对糖尿病性认知功能障碍大鼠学习记忆的改善作用及其对海马结缔组织生长因子(connectivetissuegroRNA和蛋白表达的影响。方法采用腹腔注射20g/L链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)构建糖尿病大鼠模型,将模型大鼠随机分为电针组(EA)、模型组(DM)、正常组()。电针4周后测定大鼠血糖水平,应用Morris水迷宫法观察电针对糖尿病大鼠学习记忆的影响,并用RTPCR和免疫组化方法检测海马CTGFmRNA和蛋白表达水平。结果模型组血

2、糖、上台潜伏期高于正常组和电针组(P<0.01),模型组CTGMmRNA和蛋白表达明显低于正常组和电针组(P<0.01)。结论电针能在一定程度上降低血糖,促进海马CTGFmRNA和蛋白表达,改善糖尿病认知功能障碍者的学习记忆和认知功能。【关键词】电针;血糖;学习记忆;海马;结缔组织生长因子ABSTRACT:ObjectiveToobservetheeffectofelectroacupunctureonimprovementoflearningandmemoryabilityandtheexpressionofconnectivetissuegr

3、oRNAandproteininhippocampusindiabeticratspairment.MethodsTheratdiabetesmodellydividedintothreegroups:electroacupuncturegroup(EA),diabetesmellitusuntreatedgroup(DM)andcontrolgroup().Afterfourent,bloodglucoselevelinedandtheeffectofelectroacupunctureonlearningandmemoryinedaze.RTPC

4、RRNAlevel,andimmunohistochemistryRNAandtheproteininDMprovethelearningandmemoryabilityindiabeticratspairment.KEY)13只和电针组(EA)13只,治疗过程中模型组有4只大鼠死亡,电针组有3只大鼠死亡。电针取穴参照《实验针灸学》[1],大鼠百会穴在顶骨正中,大椎穴在第7颈椎与第1胸椎棘突之间,背部膀胱经第1侧线位于脊柱正中旁开5mm。用30号1寸毫针,沿皮斜刺百会、大椎穴,刺入0.5寸,接G6805型电针仪,通以疏密波,频率14~26次/min,强度以大

5、鼠耳廓轻微颤动为度(约30mA)。每次电针15min,隔日1次,连续4周。1.2.2Morris水迷宫实验白色圆形水池直径为120cm,高60cm,平台高40cm,平台直径10cm。水池等分4个象限,任一象限放置平台。水深42cm,加入奶粉使水显乳白色。大鼠每天上、下午各训练1次,连续2周。90s仍未找到平台者,则将其放置于平台上站立10s。第2周到第4周每间隔1d后上午将大鼠从平台正对的象限入水,测定每只大鼠学习能力。观察指标为:观察90s内找到平台的时间(上台潜伏期)。1.2.3免疫组化及RTPCR实验4周末乙醚麻醉下眶后静脉采血,待查血糖。处死动物,

6、开颅取出脑,用等渗生理盐水清洗去水后迅速将大脑海马组织放入液氮中速冻,置―70℃冰箱中保存备用。选取5μm厚海马冠状切片,CTGF免疫组织化学染色(ABC法)。石蜡切片脱蜡、水化,PBS冲洗,30mL/LH2O2以阻断内源性过氧化物酶活性,一抗用兔抗鼠的CTGF(1∶100),二抗用羊抗兔IgG(1∶200),DAB显色,苏木精复染,脱水、透明,封片。每个标本随机取6张切片,每张切片随机选6个区域,每个区域面积为200μm,计数每个区域阳性细胞数,取平均值统计数据。取速冻大鼠海马约100mg,按Trizol试剂说明书方法提取总RNA。取1μg进行RTPCR

7、反应。PCRCTGF引物序列[2]分别为上游5′CTAAGACCTGTGGAATGGGC3′;下游5′CTCAAAGATGTCATTGCCCCC3′(扩增片段长383bp)。同时扩增βactin[2],其引物序列分别为上游5′GTGGGCGCTCTAGGCACCAA3′;下游5′CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC3′(扩增片段长540bp)。PCR变性、退火和延伸温度分别为94℃、55℃和72℃,反应时间分别为45s、45s和60s,共进行30个循环。循环完毕再72℃延伸10min。PCR产物用20g/L琼脂凝胶电泳分析,电泳

8、后在紫外灯下拍照,用TanonGIS1000凝胶成

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