雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠病理结构及结缔组织生长因子表达的影响

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1、雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠病理结构及结缔组织生长因子表达的影响【摘要】目的观察雷帕霉素对糠尿病肾病(DN)的保护作用。方法应用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。24只SD大鼠随机分为3组：对照组、糖尿病组、雷帕霉素组。第5周起雷帕霉素组予雷帕霉素1mg·kg-1·d-1干预8RNA及蛋白表达。结果与对照组相比，糖尿病组及雷帕霉素组大鼠血糖、Ccr、24hUalb均显著上升,大鼠肾脏明显肥大，肾小球平均体积、EMMI、毛细血管基底膜厚度均显著增加;肾皮质CTGFmRNA及蛋白表达显著上调。雷帕霉素干预后，上述指标除血糖外均部分被抑制。结论小剂量雷帕霉素能

2、够减轻肾脏肥大，抑制系膜外基质聚集，下调CTGF的表达，延缓DN的进展。【关键词】雷帕霉素;哺乳动雷帕霉素靶蛋白;结缔组织生长因子;糖尿病肾病糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要微血管病变，是糖尿病的主要死亡原因之一。早期DN主要表现为肾小球及肾小管的肥大、基底膜的增厚、细胞外基质(ECM)的异常聚集。结缔组织生长因子(CTGF)是转化生长因子β1(TGFβ1)下游的一个生物效应因子，在DN肾小球肥大及ECM的异常聚集中均发挥重要作用。雷帕霉素是一种免疫抑制剂。近年研究提示，雷帕霉素对某些慢性肾脏疾病可能具有治疗的潜力。雷帕霉素能抑制单肾切除所诱导的残余肾

3、脏肥大〔1〕，还能抑制系膜细胞增殖及Ⅳ型胶原的合成〔2〕。由于单侧肾切除所致代偿性肾肥大与糖尿病状态下肾肥大具有一定相似性，并且系膜细胞的增殖及ECM的聚集都是DN发展的关键因素。因此，本课题拟用雷帕霉素进行干预治疗，观察其对早期DN病理变化的影响及对CTGFmRNA和蛋白表达的影响。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物雄性清洁级SD大鼠24只，体重180～250g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(合格证号：SCXK沪20030003)。　　1.1.2主要试剂STZ(瑞士ALEXIS公司)，用前溶于0.1mol/L的无菌枸橼酸缓冲液中

4、，pH4.4;山羊抗人CTGF(美国SantaCruz公司产品)(对人、大鼠有反应性);兔抗山羊IgG抗体HRP多聚体(二步法免疫组化试剂)、DAB(均系北京中杉金桥生物技术公司产品);Trizol(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、10×缓冲液、dNTP(均系Fermentas公司产品);CTGF、βactin引物(上海鼎安生物科技有限公司合成)。　　1.2方法　　1.2.1DN模型的建立及分组上述大鼠随机分为对照组8只与糖尿病组16只，糖尿病组禁食12h后一次性腹腔注射1%STZ75mg/kg体重。注射后72h及1、

5、2、4mol/L、尿糖强阳性者作为糖尿病模型建立成功的标准，不达标者退出实验。将16只糖尿病大鼠再分为糖尿病组8只与雷帕霉素组8只。雷帕霉素组从第5周起予雷帕霉素1mg·kg-1·d-1灌胃治疗，对照组与糖尿病组每天经口灌胃等量溶媒0.5%羧甲基纤维素直至第12周末实验结束。　　1.2.2组织标本收集和处理第12周末，用代谢笼准确收集大鼠24h尿液，记录总尿量，取部分尿液3000r/min离心15min，吸取上层澄清尿液10ml,-20℃保存,待测尿肌酐及24h尿微量白蛋白(24hUalb)。大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后称重记录。开腹，迅速取米粒大小右

6、肾皮质于冰面上切修成1mm左右的薄片置于3%戊二醛、1.5%多聚甲醛0.1mol/LPBS(pH7.2)4℃固定，用于透射电镜检查。开胸，心脏穿刺抽血3ml离心后取血清待测血糖、血肌酐。以4℃生理盐水行心脏灌洗，直至肾脏颜色转为苍白后，迅速剥离双肾，滤纸吸干后称重记录，计算肾重体重比。取部分肾组织置于4%多聚甲醛/0.1mol/LPBS(pH7.0～7.6)固定24h，行常规病理检查及免疫组化检查;其余肾组织迅速置于干燥EP管中，投入液氮中保存，行半定量核酸检查。　　1.2.3观察指标和测定方法　　1.2.3.1生化指标检测血、尿肌酐采用自动生化分析仪进行

7、检测，尿微量白蛋白(Ualb)采用贝克曼特定蛋白分析仪检测(免疫比浊法)，体重校正的内生肌酐清除率(Ccr)计算公式：Ccr=〔尿肌酐(mmol/l)×尿量(ml)×100〕/〔血肌酐(mmol/L)×体重(g)×1440〕　　1.2.3.2肾组织病理检查蜡块切3μm薄片，分别行HE、PASM染色。光镜下观察HE、PASM染色切片的肾组织形态学改变。在400倍放大倍数下，每张HE切片按顺时针方向随机选取20个正切的肾小球，应用图像软件分析系统(ImageProPlus6.0)计算每个正切肾小球的面积(AG)。利用公式计算其体积(VG)。VG=(B/K)

8、×(AG)〔1，3〕(B是理想化的球性肾小球系数B=1.38;K是