苹果酒酵母 bat2 基因和支链氨基酸代谢对香气形成的影响

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1、苹果酒酵母BAT2基因和支链氨基酸代谢对香气形成的影响-->第一章文献综述1.1苹果酒是苹果精深加工发展的趋势1.1.1苹果产业的发展现状及问题我国是世界上盛产苹果的国家，苹果品种多，产量大。根据国家统计局统计数据（如图1-1），2003-2013年间，我国的苹果产量和苹果种植面积均呈持续增长态势，2013年产量已达3968.26万吨。在苹果产业快速发展带动农村经济发展和推动农民增收的同时，市场销售压力剧增。根据国家统计局对我国2003-2013年间苹果汁出口量及2006-2013年间鲜果出口量统计（如图1-2）可以看出，2013年苹果鲜果出口量维持在大约100吨的低位水

2、平，苹果汁出口从2009年的117万吨逐年下降到2013年的53万吨（大约合计400万吨左右鲜果），导致苹果汁加工行业呈现严重的生产过剩局面，加之有限的苹果鲜果出口量，其余的3400万吨鲜果将主要依靠国内的鲜食零售市场来消化。然而，国内苹果鲜食消费能力有限，最终导致苹果产业效益下降和卖果难的局面(阮仕立和李华2000)。数据显示，我国苹果的种植面积和产量分别占世界面积和产量的40%和50%以上，但鲜苹果和苹果汁出口量占世界出口量的比重自2007年以来呈逐渐下降趋势，这种产量与加工、销售之间的矛盾使苹果产业成为一个“高投入、高风险、高收益”的产业(赵军华等2014)。面对中

3、国苹果产业发展的巨大挑战，一方面要积极开拓国际市场，扩大出口；另一方面要积极调整产业结构，尤其是要转变苹果加工业单纯依赖浓缩苹果汁加工业的局面，进一步丰富苹果加工的途径，化解国际苹果汁市场需求低迷对我国苹果产业发展带来的不利影响，鼓励企业投资发展非酒精类果汁饮料如苹果酒等加工项目，减轻苹果销售压力，并同时提高产品附加值，促进中国苹果产业健康发展。苹果作为一个世界性生产和消费的水果，许多发达国家多年发展苹果产业的成熟经验可供我国借鉴。苹果加工业发达的国家已经减少了苹果汁这种初级的加工方式，除了鲜食之外主要加工为苹果酒、苹果醋以及苹果白兰地（inotransferasegen

4、e）基因被认为是控制支链氨基酸代谢的首要基因，该基因经过转录、翻译后产生调控支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）转变为ɑ-酮酸的转氨酶（transaminase），完成支链氨酸进入Ehrlich路径（如图2-1）转化为高级醇等挥发性香气物质的关键的第一步(Dickinsonetal.2000;EdenandBenvenisty1998;HazelotoH.etal.2002;Yvonetal.1997;Zhangetal.2013)。有报道认为BAT1基因主要在生物合成过程起重要作用，而BAT2基因在分解代谢过程中有着显著的作用，BAT2基因对支链醇、异丁酸和异戊醇等的

5、生成量有很大影响(Stygeretal.2011;Yoshimotoetal.2002)，还有研究表明BAT2基因对酿酒酵母小规模发酵过程过程中产生的高级醇及全部的香气成分有着显著的影响(Lillyetal.,2006)。综上所述，B-->AT2基因与支链氨基酸底物的分解代谢有关，因此，当系统研究38号苹果酒酵母香气形成时，BAT2基因、支链氨基酸添加量以香气物质形成的关系时，必须首先获得38(BAT2)基因工程菌株。本章以西北农林科技大学发酵动力学实验室通筛选和保存的产香浓郁的苹果酒酵母38号菌为出发菌株，通过两种基因敲除技术敲除其BAT2基因，获得38号苹果酒酵母的B

6、AT2基因缺失菌株38(BAT2)，为后续研究BAT2基因对亮氨酸和异亮氨酸代谢的影响奠定基础。2.1材料与方法2.1.1菌株和质粒质粒：pUG6为基因敲除载体（如图2-2），带有卡那霉素抗性基因，在细菌中对氨苄青霉素(Amp)有抗性，在酵母细胞中对遗传霉素(G418)有抗性，购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；pMD19-TVector购自Takara公司，用于基因克隆和测序。菌株：苹果酒酵母38号菌和大肠杆菌DH5α(用于基因克隆操作)，由本实验室保藏。2.1.2工具酶和试剂（1）1.5×CTAB：称取1.5gCTAB，加入1.0M的Tris-HCl(pH8.0)

7、75mL，0.5MEDTA30mL，再加入61.4gNaCl，用去离子水定容到100mL，于121℃，20min高压灭菌备用。（2）50×TAE：Tris121g，冰乙酸28mL，0.05mol/LNa2EDTA(pH=8.0)50mL混合后，用去离子水定容至500mL贮存备用；1×TAE：取50×TAE贮存液10mL，加蒸馏水定容至500mL。（3）EB的配制(10mg/mL)：称取10mgEB，加500μL无菌水使之完全溶解，再定容至1mL，避光保存。（4）10×TE(pH=7.5)：取1mL1MTris-HCl(pH=8