通脉注射液对脑缺血再灌注大鼠大脑皮质神经细胞n

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1、通脉注射液对脑缺血再灌注大鼠大脑皮质神经细胞N【摘要】　　【目的】观察通脉注射液对脑缺血再灌注大鼠大脑皮质神经细胞N甲基D天冬氨酸受体1（NMDAR1）mRNA表达的影响。【方法】选用SD大鼠随机分为假手术组，模型组，通脉注射液高、中、低剂量组（中药高、中、低剂量组，剂量分别为2.72、1.36、0.68g·kg-1·d-1）。除假手术组外，其他组均采用改良4血管结扎法复制大鼠全脑缺血模型，取各组大鼠大脑皮质，采用原位杂交法检测各组大脑皮质神经细胞NMDAR1mRNA阳性细胞数和染色光密度（D）值。【结果】与假手术组比较，模型组大鼠大脑

2、皮质神经细胞NMDAR1mRNA阳性细胞数和D值均显著增高（P＜0.01或P＜0.001）；与模型组比较，中药高、中剂量组阳性细胞数显著减少（P＜0.01或P＜0.001），中药高剂量组的D值显著降低（P＜0.01），而中药中、低剂量组的D值和中药低剂量组的阳性细胞数无显著变化（P＞0.05）。【结论】通脉注射液治疗缺血性中风的作用与其能抑制缺血后神经细胞NMDAR1mRNA的异常表达，减弱兴奋性神经毒性引发的神经细胞损伤有关。【关键词】通脉注射液/药理学；缺血性中风/中药疗法；脑/病理学；疾病模型，动物；大鼠　　缺血缺氧后脑组织出现严重的代谢

3、紊乱，通过释放大量的兴奋性氨基酸，过度激活相应受体，导致神经细胞产生兴奋性毒性作用，引发细胞内外多种病理过程，而致神经细胞死亡［1］。兴奋性神经毒性被认为是脑损伤的始动因素［2］。N甲基D天冬氨酸受体（NMDAR）是中枢神经系统中兴奋性氨基酸谷氨酸的特异性结合受体，在中枢神经系统广泛分布，目前被认为是中枢神经系统最重要的兴奋性递质受体［3］。本研究通过观察通脉注射液对脑缺血再灌注大鼠大脑皮质神经细胞NMDAR1mRNA表达的影响，从兴奋性神经毒性方面探讨通脉注射液治疗缺血性中风的可能机理，现报道如下。　　1材料与方法　　1.1主要药物、试

4、剂及仪器通脉注射液为静脉用注射液，由广东省中医院制剂室提供，Mupid2plus型水平电泳仪（日本Mupid公司），BGPog/L的水合氯醛经腹腔注射麻醉，俯卧位置，剪开头项部正中皮肤，分离颈项部肌肉，暴露横突翼小孔，电灼凝固双侧椎动脉，分层缝合。翻转大鼠改为仰卧位，分离颈总动脉，动脉夹夹闭双侧颈总动脉，造成弥漫性全脑缺血，全脑缺血15min后放开动脉夹，分层缝合。假手术组只予分离血管，而不结扎血管。　　1.4取材及组织切片再灌注24h后，常规水合氯醛麻醉，开胸暴露心脏并剪开心包，以12号针头经心尖插至升主动脉内，刺破右心耳后，分别以生理盐

5、水150mL、40g/L多聚甲醛—磷酸缓冲液、50g/L蔗糖200mL灌注。灌注完毕后开颅取脑浸泡于20g/L蔗糖溶液，再移入0.1mol/L磷酸缓冲液中。取大脑皮质，用振荡切片机行冠状切片，切片厚为40μm。　　1.5Dig探针标记NMDAR1cDNA探针的Dig标记及标记率按DigLabelingDetectionKit说明书进行。将标准标记探针及实验所标记探针用DNA稀释缓冲，以1∶10的稀释倍数稀释5个梯度，分别取1μL点于尼龙膜上80℃烘干。再分别用缓冲液1和缓冲液3洗膜。尼龙膜浸入含1∶5000Dig抗体的缓冲液3中，室温孵育30m

6、in。以缓冲液1和缓冲液2分别洗膜15min。显色液中避光显色20min，终止液（TE）终止反应。将标记在膜上的显色强度与标准对照，即可测出标记探针的含量。　　1.6组织切片的原位杂交分别将40μm振荡切片用0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗，0.1mol/L甘氨酸/磷酸缓冲液漂洗5min，40g/L多聚甲醛固定5min，0.1mol/L磷酸缓冲液再次漂洗10min，2.5g/L乙酸酐/0.1mol/L三乙醇室温放置10min，切片移入反应板，加20μL/切片的杂交液，42℃杂交液过夜，移入漂洗槽中，分别以4、2、1、0.5倍柠檬酸钠缓冲液（SSC

7、）漂洗，0.05mol/L磷酸缓冲液37℃漂洗，移入反应板，按50μL/切片加入1∶1000标记探针，2mol/L二硫苏糖醇室温过夜。移入漂洗槽，0.05mol/L磷酸缓冲液充分漂洗，再以缓冲液1和2分别漂洗，移入反应板，显色剂4℃显色12h，移入漂洗槽，TE终止反应，漂洗、裱片、脱水、透明，中性树脂封片，显微镜观察、摄片。另设对照：单独使用Dig标记探针。　　1.7统计学方法在光镜下细胞浆呈紫色者为NMDAR1mRNA阳性神经元。在图像分析仪上测定阳性染色细胞的染色光密度（D）值，每例随机计算每100mm2内的阳性细胞数。采用EXCEL97软

8、件进行数据的统计。统计方法为完全随机设计的多样本均数比较的方差分析及两样本均数比较的t检验，检验水平α=0.05。　　2结果　　各组神经细胞NMDAR