镉对大鼠大脑皮质神经细胞毒性损伤的机制

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1、镉对大鼠大脑皮质神经细胞毒性损伤的机制rTl。●^●’1'’‘1’hemechanlsmotcadmium-inducedcytotoxlcltyinrat’Sprimaryculturedcerebralcorticalneurons研究生：袁燕导师：刘宗平教授学科专业：临床兽医学资助项目：国家自然科学基金(3101866)扬州大学‘‘研究生科技创新计划"资助项目(2010)扬州大学2012年4月哀燕：镉对人鼠人脑皮质神经细胞毒性损伤的机制中文摘要中又捅斐镉是具有很强毒性的重金属，常见于工业场所、食品污染物和烟草中。低浓度镉就具有毒性

2、，因为其在体内的半衰期长达10～30年，易在体内蓄积，可对包括肺脏、肝脏、肾脏、睾丸、脑和胎盘在内的多个器官产生严重损害。镉可进入脑实质和神经元导致人和动物模型的神经学上的改变，引起注意力低下、痛觉敏感性高、嗅觉异常和记忆力下降。一些以神经元和神经胶质细胞为模型的体外研究表明，uM级的镉就具有神经毒性，且这种细胞毒性与诱导凋亡有一定的相关性，并得出镉致皮质神经细胞凋亡是引起中枢神经系统异常及导致记忆减退、智力发育低下的主要原因，但镉致神经细胞凋亡的机制尚未阐明。本研究用孕18～19dSpragueDawley(SD)大鼠的胎鼠建立体外培

3、养的大鼠大脑皮质神经细胞模型，通过体外试验探讨了镉对大鼠大脑皮质神经细胞的毒性损伤效应及其凋亡可能的作用机理，为进一步认识镉的神经毒性作用提供理论依据。1、镉诱导大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的线粒体途径为从线粒体途径研究镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的机制。本研究在建立体外原代大鼠大脑皮质神经细胞培养的基础上，以不同浓度(0、5、10、20gmol／L)醋酸镉染毒12h，Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡的形态变化；流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位(△、

4、，m)；实时荧光定量PCR检测Caspase一3mRNA

5、转录水平。以10gmol／L醋酸镉染毒大鼠大脑皮质神经细胞0、12、24禾H48h，免疫印迹检狈,OCaspase一9活化和PARP裂解情况。结果表明：经免疫组化染色鉴定，所培养的原代细胞为神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性，呈现典型神经细胞特征。与对照组相比，各染毒组细胞表现核皱缩、染色质致密浓染、核碎裂等典型的凋亡特征，ROS水平显著或极显著升高(P<0．05或P<0．01)，△vm显著或极显著降低(P<0．05或P<0．01)，Caspase．3mRNA转录水平极显著升高(P<0．01)，同时经10gmol／L镉处理皮质神经细胞1

6、2h后开始检测到CasDase一9活化及PARP裂解大片段。说明镉诱导大鼠大脑皮质神经细胞凋亡可能通过线粒体途径。2、钙稳态失衡在镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用为研究钙稳态失衡在镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用，并探讨内质网钙库释放在镉致神经细胞钙稳态失衡机制中的作用。本研究用不同浓度(0、5、10、20Ltmol／L)醋酸镉和细胞内钙离子螯合剂BAPTA—AM[1，2．二(2．氨基苯氧基)乙烷一N，N，N’，N’．四乙酸．四乙酰氧甲基酯，1，2-bis(2一aminophenoxy)ethane—N，N，N7，N’-tetr

7、aaceticacid—tetraacetoxymethylester(10gmol／L)1以及三磷酸肌醇受体(IP3R)特异性阻断剂2-APB[2．氨基乙氧基二二苯基硼酸盐，2．aminoethoxydiphenylborate(50gmol／L)]单独或联合作用于大鼠大脑皮质神经细胞12h。Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡的形态变化，流式细胞术检测细胞内[Cap]j，ATPase酶试剂盒测定Na+-K+-ATPase和Ca2+_M92+_ATPase活性的变化，实时荧光定量PCR测定钙调蛋t刍(CaM)mRNA转录水平。

8、结果表明，与对照组相比，染毒后的神经细胞经Hoechst33258染色呈现典型的凋亡特征，各镉染毒组细胞内[Ca2．]i极显著升高(P<0．01)，Na+-K+-ATPase和Ca2+．Mg斗一ATPase活性显著或极显著降低(P<0．05或P<0．01)，20umol／L组CaMmRNA转录水平极显著降低(P<0．01)。与相应镉染毒组相比，BAPTA．AM联合组凋亡细胞减少，BAPTA．AM联合组和2-APB联合组细胞内[CaHli显著或极显著降低fP<0．05或P<0．01)。说明镉可能通过影响CaMmRNA转录水平与维持钙稳态相

9、关酶烈a+．K+．ATPase和Ca2+_M22+．ATPase)的活性以及胞内内质网Ca2+库的释放，从而干扰神经细胞内钙稳态，而细胞内钙稳态失衡在镉诱导大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中起着重要作用。3、镉对大