自噬在镉致大鼠神经细胞毒性中的作用及调控机制.pdf

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1、自噬在镉致大鼠神经细胞毒性中的作用及调控机制Theroleandregulationmechanismofautophagyinrat’Sneuronsinjuredbycadmium研究生：王棋文导师：刘宗平教授学科专业：临床兽医学资助项目：国家自然科学基金(31101866。31302058)扬州大学2014年6月王棋义：白噬在镉致大鼠神经细胞毒性中的作用及调控机制自噬在镉致大鼠神经细胞毒性中的作用及调控机制中文摘要I鼎㈣自噬(即自体吞噬)，是一种在生理上和进化上高度保守的现象，主要依赖溶酶体降解长寿命蛋白和细胞器等物质。研究表明，环

2、境应激可诱导细胞发生自噬，自噬过程有助于维持细胞的动态平衡，但过量持续的自噬会破坏细胞器和重要的蛋白质导致细胞死亡，这种死亡方式是非caspase依赖的程序性死亡。镉是一种具有很强毒性的重金属，低浓度的镉就具有神经毒性，能严重影响神经系统的功能如神经行为学缺陷，认知障碍，活动过度等。体外研究表明镉可激活一系列级联反应，导致神经细胞发生凋亡和坏死，但关于自噬在其中的作用，尚未见有相关文献报道。本研究以PC．12细胞系和大鼠大脑皮质神经元(原代神经细胞)作为研究模型，通过体外试验探讨了自噬在镉致两种细胞毒性损伤中的作用及相关调控机制，为进一步

3、阐明镉的神经毒性作用提供了理论依据。1．镉对神经细胞活性的影响为了研究PC．12细胞培养及镉对神经细胞活性的影响。对PC．12细胞培养方法进行改进，采用MTT法测定了不同浓度镉(0、2．5、5、10、20gmol／L)染毒24hStl20gmol／L镉处理0、1、2、4、6、8、12、24h后对PC．12和原代神经细胞活性的影响。结果表明，PC．12细胞单个或两三个一起分布，形状为近似圆形，周边发出晕光，微贴壁。接种24hla,-j"细胞开始聚团，72h聚团现象更明显，生长曲线显示细胞在43h时处于对数生长期，与ATCC中的倍增时间基本一

4、致，可以用于下一步研究；随着镉处理浓度的增加和时间的延长，PC．12和原代神经细胞的活性明显降低，在一定的浓度和时间范围内，呈现明显的剂量依赖和时间依赖效应，说明镉对神经细胞具有明显的毒性作用。2．镉诱导神经细胞自噬的研究为了研究镉是否能诱导PC．12和原代神经细胞发生自噬，采用0、2．5、5、10、20gmol／L镉作用4h，20gmol／L镉作用0、2、4、6、8、12、24h，免疫印迹法检测自噬特异性蛋白LC3的表达；20pmol／L镉作用4h，免疫荧光检测聚点率，吖啶橙染色观察酸性自噬泡，MDC染色观察晚期自噬溶酶体结构的变化；2

5、0gmol／L镉作用4h和24h，透射电镜观察染毒细胞内细胞器的变化。免疫印迹结果表明，随着镉浓度的增加，LC3．II蛋白表达量显著上升，呈现一定的剂量．效应关系。随着染毒时间的延长，LC3．II的表达逐渐增加，在4h时达到最高(p

6、显增加；MDC染色揭示，对照组MDC荧光较弱，20gmol／L镉处理4h，MDC荧光信号逐渐增强，并有荧光积聚斑点；透射电镜结果表明，20gmol／L镉处理4h，两种细胞出现了典型的自噬体，处理24h，染色质开始在核周边积聚，胞质空泡化。提示镉可以诱导两种细胞发生自噬和凋亡。3启噬在镉致神经细胞损伤中的作用为了揭示自噬在镉致神经细胞毒性损伤中的作用，本研究利用镉单独或联合自噬的特异性抑制剂羟氯喹(CQ)作用4h，或联合诱导剂雷帕霉素(RAP)作用24h，对PC．12细胞和原代神经细胞LC3表达的影响，MTT法测定了CQ和RAP对两种细胞活

7、性的影响。结果表明，联合应用CQ，与4h镉处理组比较，两种细胞LC3．II的蛋白表达量显著上升(p<0．05)，但细胞活力都有明显下降(p<0．05或P<0．01)；联合应用RAP作用24h，与24h镉处理组比较，两种细胞LC3．II的蛋白表达量显著上调(p<0．05或P

8、作用24h，流式细胞术检测PC．12细胞凋亡率的变化，DAPI荧光染色观察原代神经细胞细胞核的变化。结果表明：与对照组比较，镉作用24h，PC．12细胞凋亡率从4．5％增加到45．8％，差异性