体外新生大鼠海马缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达及ca-ak通道在自噬中的作用机制

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目体外新生大鼠海马缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达及Ca-A/K通道在自噬中的作用机制研究生姓名李荣虎孙斌指导教师姓名专业名称儿科学研究方向新生儿脑损伤论文提交日期2015年4月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签

2、名：曰期：苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年—月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：Mk日期：导师签名：务應日期〈体外

3、新生大鼠海马缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达及Ca-A/K通道在自噬中的作用机制中文摘要体外新生大鼠海马缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达及Ca-A/K通道在自噬中的作用机制中文摘要目的：通过观察体外新生大鼠缺氧缺血性损伤模型，了解海马神经元的损伤情况，以及损伤后不同时间点及各组间细胞自噬变化和Ca-A/K通道亚基情况，探讨自噬抑制剂3-methyladenine（3-MA）对自噬调节及对细胞存活的影响，并初步研究缺氧缺糖后Ca-A/K通道亚基变化与自噬的关系。方法：采用新生24小时以内的SD（SpragueDawley）大鼠进行海马细胞原代培养，行氧糖剥夺(oxygeng

4、lucosedeprivation，OGD)的处理方法，模拟神经元缺氧缺血模型。选取氧糖剥夺后0h、6h、12h、24h、48h、72h、96h七个时间点，通过Westernblot及RT-qPCR法测定氧糖剥夺前后海马神经元自噬相关蛋白（LC-3、Beclin-1）、mRNA的变化和Ca-A/K通道亚基（GluR1、GluR2、GluR3）的蛋白变化；透射电镜下检测自噬的特异性结构；用CCK8法检测细胞活性，采用Fluo-3AM流式检测缺氧2+]缺血后[Cai的水平变化，应用自噬抑制剂3-MA干预后，行上述检测，初步探讨自噬和Ca-A/K通道的关系及可能机制。结果：1、

5、电镜结果显示，相比正常条件下的神经元，缺氧缺糖后神经元细胞浆内有大量自噬体形成；预先采用3-MA干预的细胞组也有自噬体形成，但比缺氧缺糖组明显降低。2、RT-qPCR结果显示，与对照组相比，缺氧缺糖组0.5h和1h组LC3、Beclin-1均表达上升，缺氧缺糖0.5h组在0h表达就开始上升，48h达到高峰后开始下降。缺氧缺糖1h组则72h达到高峰后下降，且比缺氧缺糖0.5h组表达量增高；3-MA干预1h组则在模型后6h就呈现下降，12h趋向正常水平。3、Westernblot结果发现，与对照组相比，缺氧缺糖0.5h组和1h组LC3、Beclin-1均表达升高，缺氧缺糖0.

6、5h组在6h达到高峰，48h后开始下降。缺氧缺糖1h组则I中文摘要体外新生大鼠海马缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达及Ca-A/K通道在自噬中的作用机制12h达到高峰后呈现下降趋势；且比缺氧缺糖0.5h组表达增强，3MA干预1h组在6h后呈现下降趋势；缺氧缺糖1h组的GluR1、GluR3在缺氧缺糖后6h表达上升，持续到24h后下降，而GluR2则在6h表达下降，持续到24恢复正常水平。4、CCK8结果显示，缺氧缺糖损伤恢复正常条件24h后细胞存活率为71±1%，48h存活率为80±4%，相应的在每个时间点给予3-MA预处理后细胞存活率分别为75±5%、82±4%，无显著性

7、差（p>0.05）。结论：1．成功培养了原代海马细胞并建立了体外缺氧缺血模型。2．缺氧缺糖后自噬标记蛋白LC-3、Beclin-1及Ca-A/K通道亚基GluR1、GluR2、GluR3的表达发生变化。3.在一定程度损伤内，细胞自噬会随缺氧缺糖时间延长而增加。4.3-MA可影响上述自噬相关蛋白在缺氧缺糖中的表达，抑制自噬减轻细胞损伤。5.缺氧缺糖损伤后，Ca-A/K通道发生结构改变，提示形成以GluR2亚基减少为主的新通道，介导Ca2+的快速内流，诱导细胞自噬。关键词：缺氧缺血；海马；新生大鼠；原代培养；自噬；LC3、Becl