携带nk4与il2基因真核表达载体的减毒沙门氏

《携带nk4与il2基因真核表达载体的减毒沙门氏》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、携带NK4与IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏【摘要】目的：构建携带NK4基因和IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏菌株.方法：用基因工程方法将NK4基因和IL2基因克隆入真核表达载体pcDNA4，并进行基因测序.重组质粒经鉴定后再电转入减毒沙门氏菌Ty21a中，通过PCR和酶切鉴定，并对构建的重组减毒沙门氏菌进行体外稳定性观察.结果：经PCR和酶切证实，构建了分别含NK4基因和IL2基因的重组真核表达质粒pcDNA4NK4和pcDNA4IL2，并将他们成功导入减毒沙门氏菌Ty21a中.稳定性实验结果表明该重组菌株在体外能稳定地繁殖、生长和传代.结论:

2、成功构建携带NK4基因和IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏菌株，为探索制备携带NK4和IL2基因的肿瘤减毒活疫苗奠定了基础.【关键词】NK4;基因；白细胞介素2；沙门菌属；疫苗，减毒【Abstract】AIM:ToconstructtonellatyphimuriumstrainscarryingNK4andIL2geneeukaryoticexpressionvector.METHODS:NK4geneandIL2geneedintoattenuatedSalmonellatyphimuriumstrainTy21a,andtheclonesediges

3、tion.ThestabilityofthetonellatyphimuriumstrainsedbyPCRandrestrictionenzymedigestion,rebinanteukaryoticexpressionplasmidpcDNA4NK4andplasmidpcDNA4IL2onellatyphimuriumTy21a.Therebinantstrainsstablyreproduced,greonellatyphimuriumstrainscarryingplasmidpcDNA4NK4andplasmidpcDNA4IL2canbes

4、uccessfullyconstructedandidentified,anditorexpressingrebinantlivevaccinecarryingNK4andIL2.　　【Keyonella;vaccines,attenuated　　0引言　　肝细胞生长因子(hepatocytegrophocyte,CTL)对肿瘤细胞的杀伤作用，并激活肿瘤侵润淋巴细胞从而诱导机体的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤生长停止或瘤体减小［3］.随着分子生物学的发展，IL2基因已经成为肿瘤基因治疗的热点.其在乳腺癌和黑色素瘤的Ⅰ期临床实验中取得了明显的疗效［4］.本实验我们将构建

5、含NK4基因与IL2基因的重组真核表达载体（pcDNA4NK4和pcDNA4IL2）,并将其导入减毒沙门氏菌Ty21a中，为其进一步应用提供实验依据.　　1材料和方法　　1.1材料PCAGGS/hNK4质粒(美国Davis博士惠赠),PBV220IL2质粒(北京大学医学院惠赠)，减毒沙门氏菌菌株Ty21a（中国药品生物制品检定所）,真核表达载体pcDNA4（本室保存）,T4DNA连接酶、限制性内切酶ApaⅠ,BamHⅠ,EcoRⅠ,XhoⅠ,TaqDNA聚合酶,TVector均购自TakaRa公司.质粒提取、凝胶回收试剂盒购自优晶生物工程公司.酵母提

6、取物、胰蛋白胨购自OXID公司.其余试剂均为国产分析纯.电转仪（Eppendorf德国）.　　1.2方法　　1.2.1pcDNA4NK4真核表达载体的构建根据NK4基因序列，设计了引物.引物1：5′GGATCCGCCACCATGTGGGTGAC3′，引物2:5′GGGCCCTCAGACTATTGTAGGTGT3′；以PCAGGS/hNK4质粒为模板,PCR扩增NK4基因cDNA.PCR参数为：94℃30s,55℃30s，72℃150s，循环30次.PCR产物与T载体连接，转化JM109感受态，涂布于含XGal,IPTG,Amp的LB琼脂平板培养.挑

7、取白色菌落，摇菌，提取质粒后鉴定.将构建好的TNK4质粒及真核表达载体pcDNA4分别用ApaⅠ和BamHⅠ双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收凝胶中约1.4Kb的NK4基因片段和线性化的pcDNA4，回收的NK4和pcDNA4以4∶1混合，加入T4连接酶，16℃连接12h，连接产物转化感受态JM109细胞中，涂布于LB平板上，挑取单个菌落，摇菌，提取质粒后，双酶切鉴定.　　1.2.2pcDNA4IL2真核表达载体的构建根据IL2基因序列，设计了引物.引物1:5′GAATTCCAATGTACAGGATGCACCTCC3′；引物2:5′CTCGAGAGT

8、TAGT