携带NK4与IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏菌的构建.doc

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1、携带NK4与IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏菌的构建【摘要】目的：构建携带NK4基因和IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏菌株.方法：用基因工程方法将NK4基因和IL2基因克隆入真核表达载体pcDNA4，并进行基因测序.重组质粒经鉴定后再电转入减毒沙门氏菌Ty21a中，通过PCR和酶切鉴定，并对构建的重组减毒沙门氏菌进行体外稳定性观察.结果：经PCR和酶切证实，构建了分别含NK4基因和IL2基因的重组真核表达质粒pcDNA4NK4和pcDNA4IL2，并将他们成功导入减毒沙门氏菌Ty21a中.稳定性

2、实验结果表明该重组菌株在体外能稳定地繁殖、生长和传代.结论:成功构建携带NK4基因和IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏菌株，为探索制备携带NK4和IL2基因的肿瘤减毒活疫苗奠定了基础.【关键词】NK4;基因；白细胞介素2；沙门菌属；疫苗，减毒【Abstract】AIM:ToconstructtworecombinantattenuatedSalmonellatyphimuriumstrainscarryingNK4andIL2geneeukaryoticexpressionvector.METHODS:NK

3、4geneandIL2genewereobtainedbyPCR,thenclonedintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA4.Therecombinantswereidentified,andtransformedintoattenuatedSalmonellatyphimuriumstrainTy21a,andthecloneswerescreenedbyPCRandrestrictionenzymedigestion.Thestabilityofthetworecombin

4、antattenuatedsalmonellatyphimuriumstrainswasevaluated.RESULTS:ConfirmedbyPCRandrestrictionenzymedigestion,recombinanteukaryoticexpressionplasmidpcDNA4NK4andplasmidpcDNA4IL2wereconstructedsuccessfully,andthenintroducedintoanattenuatedSalmonellatyphimuriumTy2

5、1a.Therecombinantstrainsstablyreproduced,grewandpassagedinvitro.CONCLUSION:TherecombinantattenuatedSalmonellatyphimuriumstrainscarryingplasmidpcDNA4NK4andplasmidpcDNA4IL2canbesuccessfullyconstructedandidentified,anditwillhelptodevelopatumorexpressingrecombi

6、nantlivevaccinecarryingNK4andIL2.　　【Keywords】NK4;genes;interleukin2;Salmonella;vaccines,attenuated　　0引言　　肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)是由间质细胞产生的多功能细胞因子，具有强促分裂、组织形成、诱导上皮细胞迁移，侵袭及诱导血管生成等作用,这些都有利于肿瘤组织的发生与发展［1］.51997年Date等［2］用胰弹性蛋白酶对重组人HGF进行消化裂解，发现了一种新的全面拮抗

7、HGF生物活性功能的拮抗剂NK4.NK4作为HGF的拮抗剂能显著抑制肿瘤细胞的生长、增殖和转移,在肿瘤基因治疗中有潜在的应用前景.　　白细胞介素2(interleukin2,IL2)又称T细胞生长因子，是机体免疫调节中的重要细胞因子之一，可通过提高自然杀伤细胞与LAK细胞活性，增强细胞毒性T细胞(cytotoxictlymphocyte,CTL)对肿瘤细胞的杀伤作用，并激活肿瘤侵润淋巴细胞从而诱导机体的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤生长停止或瘤体减小［3］.随着分子生物学的发展，IL2基因已经成为肿瘤基因治疗的

8、热点.其在乳腺癌和黑色素瘤的Ⅰ期临床实验中取得了明显的疗效［4］.本实验我们将构建含NK4基因与IL2基因的重组真核表达载体（pcDNA4NK4和pcDNA4IL2）,并将其导入减毒沙门氏菌Ty21a中，为其进一步应用提供实验依据.　　1材料和方法　　1.1材料PCAGGS/hNK4质粒(美国Davis博士惠赠),PBV220IL2质粒(北京大学医学院惠赠)，