四嗪二甲酰胺体外诱导nb4细胞增殖、凋亡与分化作用的研究.doc

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1、四嗪二甲酰胺体外诱导NB4细胞增殖、凋亡与分化作用的研究作者：周永列，吕亚萍，胡惟孝，邱莲女，王文松，吴建国，刘建栋【摘要】为了观察四嗪二甲酰胺是一种咪唑四嗪类口服抗肿瘤药，属于不对称四嗪类化合物。四嗪二甲酰胺(ZGDHu-l)是一种新颖的对称四嗪化合物，是胡维孝等［1，2］改进了合成方法而设计并合成的经结构多种修饰的3，6-二甲基-1，4二氢-1，2,4，5-四嗪类化合物。经药物构效学筛选，其中ZGDHu-l具有较强的抗肿瘤作用［3］，有望成为一种具有自主知识产权的抗癌新药。为了研究ZGDHu-l抗血液肿瘤的作用

2、及其作用途径，我们以急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4为模型，体外观察了ZGDHu-l对NB4增殖、分化和凋亡的作用，并探讨其作用的分子机制。材料和方法材料ZGDHu-l由浙江工业大学药学院制药工程研究所合成，系白色片状结晶。用二甲亚砜溶解配制贮存液，浓度为lmg/ml,应用液用含10%的小牛血清的RPMI1640配制。二甲亚讽、p塞哩蓝、蛋白酶K、TPA、全反式维甲酸为Sigma公司产品；NBT购自Fluck公司；DNA-Prepkit(内含透膜剂，RNase和PI)为美国Beckman-Coulter公司产品；A

3、nnexin-V和P四嗪二甲酰胺体外诱导NB4细胞增殖、凋亡与分化作用的研究作者：周永列，吕亚萍，胡惟孝，邱莲女，王文松，吴建国，刘建栋【摘要】为了观察四嗪二甲酰胺是一种咪唑四嗪类口服抗肿瘤药，属于不对称四嗪类化合物。四嗪二甲酰胺(ZGDHu-l)是一种新颖的对称四嗪化合物，是胡维孝等［1，2］改进了合成方法而设计并合成的经结构多种修饰的3，6-二甲基-1，4二氢-1，2,4，5-四嗪类化合物。经药物构效学筛选，其中ZGDHu-l具有较强的抗肿瘤作用［3］，有望成为一种具有自主知识产权的抗癌新药。为了研究ZGDHu

4、-l抗血液肿瘤的作用及其作用途径，我们以急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4为模型，体外观察了ZGDHu-l对NB4增殖、分化和凋亡的作用，并探讨其作用的分子机制。材料和方法材料ZGDHu-l由浙江工业大学药学院制药工程研究所合成，系白色片状结晶。用二甲亚砜溶解配制贮存液，浓度为lmg/ml,应用液用含10%的小牛血清的RPMI1640配制。二甲亚讽、p塞哩蓝、蛋白酶K、TPA、全反式维甲酸为Sigma公司产品；NBT购自Fluck公司；DNA-Prepkit(内含透膜剂，RNase和PI)为美国Beckman-Cou

5、lter公司产品；Annexin-V和PI试剂系BenderMedSystems公司产品；bcl-2单克隆抗体，bax单克隆抗体及用于bcl-2,bax检测的透膜剂、⑶lib、CD13及同型对照均系法国Immunotech公司产品。Hoechst33258试剂系CalBiochem公司产品。PE标记的鱗酸化P38MAPK单克隆抗体和磷酸化STAT3单克隆抗体购自Bioscience公司；hTERT-mRNA实时荧光定量PCR试剂盒由Roche公司提供。细胞培养NB4细胞株引自浙江大学血液病研究所。采用含10%的小牛

6、血清的RPMI1640并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸及青霉素和链霉素(100ug/ml)的培养体系培养。培养环境为37°C、5%的C02培养箱。取对数生长期的细胞进行实验。细胞活率、细胞计数和形态观察以2X105/ml的细胞浓度，分别接种于含9种浓度不同的ZGDHu-1的培养液中，并设10ug/ml的ATRA作为阳性对照组和不加药物的空白对照组，每瓶含5ml。培养24、48和72小时，计数各组细胞数，计算细胞增殖抑制率，用4%台盼蓝染色，计数活细胞数。每次每瓶计数3次，实验重复3次，绘制细胞增殖和活力曲线。取药物作用后各

7、组的细胞先在倒置显微镜下观察，再将细胞悬液离心涂片，用Wright-Giemsa染色，光镜下观察细胞形态变化。ZGDHu-1对NB4细胞生长影响的MTT测定调整细胞浓度为5X104/ml，接种于96孔无菌培养板中，每孔200Pl。实验组、阳性对照组和空白组的设置同细胞活率和计数测定。每组每个浓度下设3个复孔，实验重复3次。培养24、48和72小时后用MTT法读取吸光度值，计算抑制率并绘制剂量效应曲线，求出Z⑶Hu-1对NB4细胞的半数抑制浓度(IC50)。凋亡细胞的AnnexinV/PI标记染色测定调整细胞浓度2X

8、105/m1的，分别接种于含6种不同ZGDHu-1浓度的培养液中，并设10Pg/ml的ATRA作为阳性对照组和不加药物的空白对照组，每瓶含5ml。培养12小时后轻轻收获细胞1X106个，用冷PBS洗1遍后置0°C水浴中，力P490u1结合缓冲液，轻轻混匀后加5u1HTC-AnnexinV和5ulPI,10分钟后用流式细胞仪检测。细胞周期和DNA倍体分析分组方