丙型肝炎病毒1b dy株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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1、丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达：付慧，楚雍烈，张丽莉，曹美茹，成凡，茹小荣，王勇健【摘要】目的克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物，采用巢式PCR法，从含HCV1bDY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出约480bp的目的片段，将其插入克隆载体pMD18Tvector中，再亚克隆到原核表达载体pET28a中；经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株，在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达；采用SDSPAGE电泳及ethodsByusingtheprokaryoticcel

2、lgeneengineering,HCVns5ageneplifiedtheplasmidHCV17ofHCV1bstrainDYfulllengthgeneandinsertedintothecloningpMD18Tvector.TheclonedHCVns5ageneethods.ResultsRebinantexpressionplasmidpet28ans5aightbehelpfulforfurtherstudiesonthenatureandbiologicalpropertiesofthens5agene.　　KEY109、DH5a、BL21及原核表达载体pET2

3、8a(+)均为本实验室保存，pMD18T载体购自TaKaRa公司。　　1.1.2酶及生化制剂DNA限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ及T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；其他所用试剂主要购自北京天为时代或鼎国公司。　　1.2方法　　1.2.1质粒提取及纯化利用碱裂解法小量提取含HCV1bDY株全长的HCV17质粒DNA及pET28a质粒DNA(阴性对照质粒)，并纯化。　　1.2.2引物的设计与合成参考NCBI记录的HCV1b各株序列，选取NS5AISDR两侧高度保守区段设计目的基因的特异性引物(表1)，由上海生物工程公司合成。　　表1引物序列（略）　　Table1Locationand

4、sequenceofprimerofamplification　　1.2.3目的基因的扩增利用巢式PCR，依次加入体系中的各成分，以HCV17质粒为模板外引物扩增，再以外引物扩增产物为模板进行内引物扩增。内外引物进行PCR循环，参数如下：94℃预变性10min，94℃变性1min，58℃退火1min30s，72℃延伸1min，进行30次循环，最后72℃延伸10min。设立阴性对照，以pET28a质粒DNA为模板进行同样扩增。10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。　　1.2.4PCR产物与pMD18Tsimplevector连接具体操作按照pMD18Tsimplevector使用说明

5、进行，获得含目的基因的重组质粒。把重组质粒pMDTns5aDNA经转化氯化钙法制备的感受态细胞E.coli.JM109，从Amp+IPTG/XGaLLB平板筛选白色菌斑，Amp+LB液体培养基培养过夜，提取质粒，进行PCR、酶切鉴定。　　1.2.5克隆HCVns5a基因的序列比对分析将重组pMD18Tns5a质粒送北京华大基因公司测序，将测序结果与HCV标准株HCVJ序列[3]进行比对分析。　　1.2.6原核表达载体的构建将阳性的重组质粒pMD18Tns5a用限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，目的基因片段凝胶回收kit进行纯化、回收及定量，与经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切

6、的表达载体pET28a(+)用T4DNA连接酶连接，转化氯化钙法制备的感受态BL21菌，挑取重组菌落扩大培养，提取质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切和PCR再扩增分析，并送华大基因公司测序鉴定。　　1.2.7融合蛋白的诱导表达及活性检测挑取单个菌落在含卡那霉素的LB液中过夜复苏，然后按1∶100接种同样的培养基，37℃通气培养至A600值为0.6左右时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导，分别在诱导0h(未诱导)、1、3、5、7h各取1mL重组菌培养物，同时设空载体诱导作为阴性对照，进行上样处理，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色。对表达蛋白进行:200bpla

7、ddermarker;1-3:HCV17PCRproduct,about500bp;4:negativecontrol　　2.2目的基因插入克隆载体pMD18T的鉴定利用分子克隆技术，对目的基因进行亚克隆，构建克隆载体pMD18Tns5a，进行蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌落，培养并抽提质粒，进行电泳粗筛、PCR、酶切鉴定。结果显示PCR扩增得到约500bp的产物，与目的基因大小相符；酶切大片段约2.7kb，与pMD