livin、caspase―8在人骨肉瘤组织中的表达及临床意义

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Livin>Caspase—8在人骨肉瘤组织中的表达及临床意义［摘要］目的探讨Livin、Caspase-8在人骨肉瘤组织中的表达及临床意义。方法选择2008年3月〜2015年3月于唐山市人民医院就诊的骨肉瘤患者64例为观察组，取其骨肉瘤组织作为生物样本；选择同期就诊的非骨肉瘤患者64例为对照组，取其正常骨痂组织作为生物样本。按照骨肉瘤诊治规范对相关生物样本进行分析，分析观察组所有样本的肿瘤位置、肿瘤大小、病理分型、Enncking分期等；检测两组样本中Livin和Caspase-8的表达水平；分析其与肿瘤生物学行为的相关性。结果Livin在观察组骨痂组织中阳性表达率显著高于对照组(P0.05)，而肿瘤的大小、Enncking分期和患者最终生存时间与Livin和Caspase-8的表达相关(P［关键词］骨肉瘤;Livin蛋白；Caspase-8蛋白;临床意义［中图分类号］R738.1［文献标识码］A［文章编号］1674-4721(2016)10(c)-0033-04[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheexpressionandclinicalsignificanceofLivinandCaspase-8inhumanosteosarcoma.MethodsTheosteosarcomacancertissues of64patientswithosteosarcomacancerwhowereexaminedandtreatedinTangshanPeople’sHospitalfromMarch2008toMarch2015werecollectedastheobservationgroup.Another64patientswithnon-osteosarcomacancerwereselectedasthecontrolgroup.Therelevantbiologicalsampleswereanalyzedinaccordancewiththestandardofdiagnosisandtreatmentofosteosarcomacancer.Thetumorlocation，tumorsize，pathologicaltype，Ennckingstageandsoonoftheobservationgroupwereanalyzedandobserved.TheexpressionlevelofCaspase-8andLivinwasdetectedinthetwogroupsanditscorrelationwithtumorbiologicalbehaviorwasanalyzed.ResultsThepositiveexpressionrateofLivinintheobservationgroupwassignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup(P0.05),however，tumorsize，EnnckingstageandthefinalsurvivaltimewerecorrelatedwiththeexpressionofCaspase-8andLivinprotein(P在我国，骨肉瘤的发病对象主要为青少年儿童，且近年来的发病率有逐年上升的趋势［1］，对社会稳定和青少年生命健康和安全造成了严重的影响［2］。目前，临床对于骨肉瘤的发病机制研宄尚不完全清晰，诸多学者 认为［3］，细胞正常凋亡受阻可能直接参与了骨肉瘤的发生、发展［4］。Livin是最新发现的人凋亡抑制蛋白家族中的一种蛋白因子，半胱天冬酶（Caspase）则是一类在进化上非常保守的蛋白酶类分子［5］。其中，Caspase-8参与到细胞凋亡过程中［6］。本研宄旨在探讨Livin、Caspase-8在人骨肉瘤组织中的表达及临床意义，从而揭示骨肉瘤发病可能的生物学机制，为临床生物分子药物寻找有效靶点提供依据。1资料与方法1.1一般资料选择2008年3月〜2015年3月于唐山市人民医院（以下简称“我院”）就诊的骨肉瘤患者64例为观察组，取其骨肉瘤组织作为生物样本，其中男38例，女26例，平均年龄（19.8±2.6）岁。选择同期我院就诊的非骨肉瘤患者64例为对照组，取其正常骨痂组织作为生物样本，其中男38例，女26例；平均（20.2±2.2）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P〉0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。1.2纳入与排除标准纳入标准：①符合临床诊断标准，其中骨肉瘤诊 断符合全国软组织和骨肿瘤病理诊断学术研讨会论文汇编上制定的标准，且经影像学检查和病理组织学检查确诊。②心智健全，有自主判断能力。③术前未接受放化疗等治疗。④知情同意并签署知情同意书。排除标准：患有器质性疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病、精神性疾病，以及无法配合治疗者。1.3方法1.3.1两组骨痂组织中Livin和Caspase-8的检测方法本研宄中使用工作液浓度为1:100的Livin鼠抗人单克隆抗体，购于Abeam公司；工作液浓度1:50的Caspase-8兔抗人多克隆抗体购于ABclonal公司；PBS粉剂和免疫组化MaxVisionTM/AP试剂盒购于杭州艾康生物技术有限公司。采用标准方法制作石蜡切片，即福尔马林固定和石蜡包埋，设定切片厚度为4um。采用免疫组化MaxVisionTM/AP法行Livin和Caspase-8检测，按照产品说明书步骤严格执行，阴性对照为PBS代替一抗，对照为对照组受试者的正常骨痂组织切片。1.3.2结果判定标准细胞中可见棕黄色细小颗粒，可认定为阳性染色的Livin蛋白或Caspase-8蛋白。在400倍显微镜下记录每张切片的10个视野，观察每个视野中100个细胞的染色状况。判定标准要根据阳性 染色的细胞数目和细胞染色强度进行判定，阳性染色细胞占比的评定标准：阳性染色的细胞占比50%〜75%,记为3分；阳性染色的细胞占比＞75%，记为4分。细胞染色强度的评定如下：染色强度为淡黄色，记为1分；染色强度为棕黄色，记为2分；染色强度为棕褐色，记为3分。将阳性染色的细胞数目得分与细胞染色强度得分相乘，得出最终结果。总分＞3分为阳性，总分0.05)，而肿瘤的大小、Enncking分期和患者最终生存时间与Livin和Caspase-8的表达相关(P结果显示，骨肉瘤组织Livin表达水平明显偏高，且显著高于正常骨痂组织，且Livin的阳性表达还与骨肉瘤的肿瘤大小、Enncking分期及患者最终生存时间有关。在直径较大、Enncking分期处于IIB〜III期和最终生存时间短于5年的患者体内Livin阳性表达率显著升高。进一步研究Caspase-8蛋白后发现，骨肉瘤组织细胞内的Caspase-8表达水平明显低于正常骨痂组织。且Caspase-8表达与肿瘤细胞病理因素之间的关系与Livin蛋白与肿瘤细胞病理因素之间的关系一致。Caspase-8蛋白在直径较大、Enncking分期处于IIB〜III期和最终生存时间少于5年的患者体内的阳性表达显著下降。进一步分析Caspase-8蛋白和Livin蛋白之间的相关性可以发现，骨肉瘤组织中Caspase-8蛋白的表达与 Livin蛋白呈负相关。由此说明，Livin对细胞凋亡具有抑制作用[13-14]，且也有可能可以抑制Caspase-8蛋白的表达。Caspase-8蛋白介导的细胞外凋亡途径中，Caspase-8蛋白活化Procaspase-3时需要去除prodomain,之后才能启动核心蛋白酶Caspase-3的凋亡作用。Livin蛋白可能可以抑制prodomain的去除，从而抑制之后的一系列凋亡过程[15-20]。根据研究结果，Livin蛋白和Caspase-8蛋白具有作为治疗骨肉瘤基因靶点的潜力。综上所述，Livin在骨肉瘤组织中表达量显著升高，而Caspase-8在骨肉瘤组织中表达量显著降低，且与骨肉瘤的肿瘤的大小、Enncking分期和患者最终生存时间有关。[参考文献][1]MorrowJJ,KhannaC.Osteosarcomageneticsandepigenetics：emergingbiologyandcandidatetherapies[J].CritRevOncog,2015，20(3-4):173-197.[2]MoriarityBS,OttoGM,RahrmannEP,etal.ASleepingBeautyforwardgeneticscreenidentifiesnewgenesandpathwaysdrivingosteosarcomadevelopmentandmetastasis[J].NatGenet,2015，47(6):615-624. 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