脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究

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纷失幸硕士学位论文脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究学科专业内科学学位类型回科学学位口专业学位研究生姓名肖日军导师姓名、职称张娜教授论文编号湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一零年五月 二分类,万密级学校代码学号脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究研究生姓名肖日指导教师姓名、职称张娜教授学科专业内科学了内分泌专业研究方向糖尿病足湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一零年五月 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究摘要目的探讨脐血干细胞静脉输注治疗治疗糖尿病大鼠下肢缺血模型的有效性和安全性。方法制备糖尿病下肢缺血大鼠模型。将只糖尿病下肢缺血大鼠随机分为组,组二生理盐水肌注组组生理盐水尾静脉输注组组骨髓干细胞肌注组组骨髓干细胞尾静脉输注组组二脐血干细胞肌注组组脐血干细胞尾静脉输注组。进行干细胞局部肌肉注射或尾静脉输注。分别检测并比较组糖尿病下肢缺血大鼠左下肢血管内皮生长因子含量及毛细血管密度。结果脐血干细胞移植组、组较对照组、组左下肢含量及毛细血管密度明显增高。静脉输注移植组、组较对照组组左下肢含量及毛细血管密度明显增高。骨髓干细胞移植组、组与脐血干细胞移植组、组比较,左下肢含量及毛细血管密度无统计学差异,干细胞肌注组、组与尾静脉输注组、组比较,左下肢含量及毛细血管密度无统计学差异尸。结论①脐血干细胞移植能增加糖尿病大鼠下肢缺血局部和毛细血管密度②静脉输注干细胞能增加糖尿病大鼠下肢缺血局部和毛细血管密度③静脉输注脐血干细胞可能成为糖尿病足下肢缺血治疗的有效途径。公 硕士学位论文关键词脐血干细胞,骨髓干细胞,糖尿病足,下肢缺血,干细胞移植 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究,,,,,姗·,,,今 硕士学位论文,,,,,①即娜印,②即娜,③,,, 目录中文摘要··································································……英文摘要··································································……引言···········································································……第一章材料和方法···················································……'`'实验动物························································……主要药品和试剂······················································……主要试剂的配置····················································……“主要仪器设备·························································……糖尿病动物模型的建立·············································……糖尿病下肢缺血模型的建立·········……”······················……骨髓干细胞的分离···················································……人脐血采集························································……'人脐血干细胞的分离···················································……干细胞活力检测·························································……干细胞计数··························································……””'实验分组及移植方法·············································……糖尿病大鼠左下肢组织中血管内皮生长因子含量的检测·····································································……糖尿病大鼠左下肢肌肉中毛细血管密度的测定············……华 1.巧研究步骤流程图···················································……统计学分析······················································……第二章结果·······························································……雄性大鼠诱导糖成尿病后的表现·····················……糖尿病下肢缺血模型的表现····································……糖尿病大鼠死亡原因分析·······································……干细胞活性检测结果·············································……干细胞移植后安全性分析·······································……糖尿病下肢缺血大鼠干细胞移植后左下肢含量······……糖尿病下肢缺血大鼠干细胞移植后左下肢毛细血管密度……巧第三章讨论·······························································……结论··································································……参考文献·························································……综述·······························································……主要缩写词表····························································……致谢········································································……在读期间发表的主要学术论文及参与课题························…… 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究日层旨二刁脐血干细胞是指从脐血中提取具有自我更新和多重分化潜能的细胞,在特定微环境中,可诱导分化为内皮细胞。目前研究把细胞作为干细胞。在临床干细胞移植中,由于细胞检测需应用免疫标记的抗体,因此无法将分离后的细胞输入患者体内。而干细胞体外培养增加了感染、基因重排及发生肿瘤的机会。而脐血单个核细胞中包含细胞、造血前体细胞及各种丰富的细胞因子。分离脐血单个核细胞操作容易规范,因此临床上脐血干细胞移植多采用脐血单个核细胞进行。异体或异种干细胞移植中,免疫排斥反应是决定移植成败的关键。而脐血干细胞更为原始,抗原性弱,免疫排斥反应低,,是异体或异种干细胞移植的新的选择。因此,我们用人脐血干细胞异种移植糖尿病大鼠下肢缺血模型,探讨脐血干细胞移植的安全性。目前,采用诱导糖尿病大鼠,结扎下肢血管造成局部缺血是常用的模拟糖尿病足的动物模型。该模型具备糖尿病足下肢缺血的基本要点高血糖和局部缺血。糖尿病足是糖尿病患者致残、致死的重要原因之一,能否改善下肢血供对糖尿病足治疗具有至关重要的作用。对于糖尿病足下肢缺血的治疗,目前有三种方法,,,即药物、血管介入以及手术搭桥。药物治疗无法从解剖上改变血管的狭窄和闭塞。血管内介入治疗对糖尿病多发的膝下病变效果差,再狭窄率高'”。立 硕士学位论文血管搭桥手术的远期疗效不理想,高龄、合并心脑血管疾病的患者很难耐受川。对于下肢动脉流出道闭塞且缺乏代偿性侧支形成的糖尿病足患者,干细胞移植是唯一的选择。年等【'首次采用干细胞移植治疗下肢缺血性疾病,取得了良好效果。其方法为分离骨髓单个核细胞进行下肢缺血局部注射。目前,国内谷涌泉教授以及多家单位进行糖尿病足干细胞移植已逾千例【”,方法为分离骨髓或外周血单个核细胞进行缺血局部注射。脐血干细胞移植治疗糖尿病足能否取得骨髓或外周血干细胞移植同样的效果,目前尚不明确。而脐血干细胞移植较骨髓或外周血干细胞移植有其独特的优势①脐血干细胞来源广泛,取材方便,不会造成痛苦②富含多种分化潜能的细胞、造血前体细胞及细胞因子,对缺血局部作用更强【'③脐血干细胞抗原性低,发生免疫排斥反应机会少④脐血有胎盘的过滤保护,发生感染的机会更少。而骨髓干细胞移植如为异体移植需进行严格配型。如为自体移植,则需大量采集患者自体骨髓,最多需,采集骨髓时需硬膜外麻醉或全身麻醉,高龄、长病程患者难以耐受。而糖尿病足患者骨髓干细胞中内皮祖细胞的功能较正常明显下降,将影响移植的效果。外周血干细胞移植如为异体移植同样需进行严格配型,临床可操作性差。由于外周血细胞含量很少,为增加含量、提高移植效果,需预先进行动员,即应用人粒细胞集落刺激因子刺激骨髓干细胞增殖、释放入外周血,增加外周血中干细胞数量,然后再采集。由于动员后,血液呈高凝状态,而糖尿病足患者多合并心、脑血管疾病,易发生中风和心肌梗死。因此,如果脐血干 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究细胞移植和骨髓及外周血干细胞移植同样有效,那么脐血干细胞移植来源更广泛,移植方法更简单,将成为糖尿病足治疗的新选择。因此我们采用脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血模型,并将其与骨髓干细胞移植比较,探讨脐血干细胞移植是否与骨髓干细胞移植同样有效。目前,糖尿病足干细胞移植的主要途径为分离自体骨髓或外周血单个核细胞在下肢缺血局部肌肉注射【'“,'。但局部注射仍有一定创伤,可能导致局部感染。而且需多点注射,增加患者的痛苦,常采用硬膜外麻醉或腰麻,高龄合并心脑血管疾病患者难以耐受。干细胞具有“归巢”特性”,能自动向损伤部位迁移。有研究者采用静脉输注骨髓或人脐血口'单个核细胞治疗心肌梗死动物模型,干细胞能够迁移至梗死局部,促进血管新生,改善心肌重构。因此,如果静脉输注干细胞进行干细胞移植的安全性和有效性能得到证实,静脉输注途径较局部注射途径更为简单。干细胞静脉输注的安全性主要存在于输注的干细胞可能滞留于其他组织和器官发生肿瘤。但肿瘤的发生和组织或器官局部微环境及机体免疫状况密切相关,可能存在更为复杂的机制。干细胞移植后,缺血局部新生血管的情况可通过及毛细血管密度来反映。是血管内皮生长因子家族中较具代表性的一种,是最重要的促血管生成因子。缺血时可上调及其受体的表达四,诱发毛细血管再生。毛细血管密度可通过检测血管内皮细胞的姗因子来完成,因子主要存在血管内皮细胞的胞浆中,因此可以作为鉴定血管内皮细胞的特异性标志'。目前,尚缺乏静脉输注干细胞治疗糖尿病足下肢血管病变的临床及实验研究。因此,我们采用静脉输注干细胞治疗糖尿病下肢缺血大乙 硕士学位论文鼠模型,并与局部肌肉注射进行比较,探讨静脉输注干细胞移植的有效性和安全性,为临床糖尿病足下肢缺血干细胞移植的途径进行新的探索。 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究第一章材料和方法实验动物雄性大鼠只,约周龄,体重在一之间,级,购于湖南农业大学动物部。主要药品和试剂化学药品链脉佐菌素美国公司柠檬酸长沙市分路口塑料化工厂柠檬酸三钠长沙市分路口塑料化工厂二甲苯湖南明瑞化工公司乙醇上海慈太龙实业有限公司苏木素成都市科龙化工试剂厂试剂人淋巴细胞分离液天津颖阳公司低糖培养液公司液福建迈新生物有限公司兔抗大鼠姗因子抗体美国公司台盼蓝碧云天生物有限公司液福建迈新生物有限公司水合氯醛中南大学湘雅一医院制剂室 硕士学位论文多聚甲醛长沙飞海贸易有限公司普通胰岛素江西徐州生物化学制药厂试剂盒试剂盒武汉博士德公司一检测试剂盒北京中杉金桥公司显色试剂盒武汉博士德公司主要试剂的配置比,柠檬酸缓冲液的配制第一步配制液比柠檬酸水溶液柠檬酸加入蒸馏水至。第二步配制液几柠檬酸钠水溶液柠檬酸钠加蒸馏水至。第三步液液再加蒸馏水至,即可配制形成几,柠檬酸盐缓冲液。溶液配制链脉佐菌素在几,柠檬酸缓冲液溶解,配制成的溶液,滤器除菌,现用现配,配好的溶液置冰盒中保存,运输。台盼兰工作液的配置台盼兰溶于的液中,再配成的台盼兰工作液,℃保存备用。主要仪器设备血糖仪美国罗氏公司 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究血糖试纸美国罗氏公司超速离心机德国公司超低温离心机美国公司电热恒温水浴箱田,一型生物组织自动脱水机湖北亚光医用电子,型石蜡切片德国,型一℃超低温冰箱海尔公司,一型,电子天平美国公司,型普通光学显微镜日本田,型彩色病理图文分析系统湖北亚光医用电子一系列细胞计数板上海精密仪器厂石蜡包埋机湖北亚光仪器有限公司,一型超净工作台上海索普仪器有限公司酶标仪普朗,一型糖尿病动物模型的建立雄性大鼠只,约周龄,体重在一之间,每笼只饲养,温度控制在士℃,饲料留定量供应,自由饮水。经适应性饲养周后行诱导。诱导前禁食,按体重给予以几、无菌柠檬酸檬酸钠缓冲液临用时配制成浓度腹腔一次性注射。雄性大鼠腹腔注射,周后,断料不断水,剪尾测血糖,连续测得血糖浓度习几,即认为糖尿病大鼠造模成功。对症状较重的糖尿病大鼠腹腔注射普通胰岛素一,以降低死亡率。 硕士学位论文糖尿病下肢缺血模型的建立己造膜成功的糖尿病雄性大鼠只,每只以水合氯醛按服腹腔注射麻醉,常规备皮,消毒后肢,铺无菌铺单,沿左侧腹股沟中点至膝内侧作约长的切口,钝性分离皮下组织,暴露股神经血管鞘及其分支,分离出股动脉及大隐动脉、旋骼外动静脉及股动静脉肌支共四处,分别用号线结扎后切断。再逐层缝合组织皮肤,注射青霉素万只,连续天,预防感染。骨髓干细胞的分离雄性大鼠只,颈椎脱臼法处死,用的酒精浸泡消毒,在已消毒的手术室,无菌分离四肢长骨,消毒针头在大鼠股骨两端各穿小孔,液反复冲洗骨髓,等倍稀释骨髓液,将骨髓冲洗液按比例加入人淋巴细胞分离液液上,淋巴细胞分离液比重士稀释后骨髓稀释液,淋巴细胞分离液,共,密度梯度离心,离心分钟后分五层,中间白膜层即为单个核细胞。用移液器小心吸取富含单个核细胞的悬液放入另一离心管内,℃,,离心分钟,洗涤次。用低糖培养液悬浮计数,备用。人脐血采集选择排除、、、、、梅毒等急、慢性感染、无血液系统疾患及其他系统疾病的非高危妊娠健康足月产妇。脐血捐献者自愿捐献,且同意用于科学研究和临床治疗。新生儿为经阴道顺产且生后皮肤红润,四肢活动良好,无感染征象的脐血。待新生儿娩出后,立即在距脐轮一处钳夹结扎脐带并切断。消毒脐带侧,行脐静脉穿刺。脐带胎盘血借宫缩力流入采血袋内袋内预先含 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究有无菌抗凝剂,摇动均匀,`直至无脐血流出为止。人脐血干细胞的分离取新鲜脐血,在小时内用毕。在超净工作台上、无菌条件下,消毒穿刺部位,用液等倍稀释脐血,置于离心管中,按比例加入人淋巴细胞分离液液上,淋巴细胞分离液比重士,稀释后脐血,淋巴细胞分离液,共。,,离心分钟后脐血分五层,中间白膜层即为单个核细胞。用移液器小心吸取富含单个核细胞的悬液放入另一离心管内。℃,,离心分钟,洗涤次。用低糖丑培养液悬浮计数,备用。干细胞活力检测取台盼蓝配制、培养基、原代细胞悬液充分混匀,用血球计数板计数活细胞未着色细胞和死细胞着色细胞,共计数个细胞,计算细胞活力。细胞活力二细胞总数一着色细胞数细胞总数。干细胞计数调整单个核细胞的悬液至,取单个核细胞的悬液同时吸取台盼蓝台盼蓝,配制放入管内混匀。用酒精清洁计数板和盖玻片,然后用吸水纸轻轻擦干,将盖玻片盖在计数板两槽中间。用移液器轻轻吹打细胞悬液,然后取管内液体,在计数板上盖玻片一侧加细胞悬液,加样量不要溢出盖玻片,用物镜观察计数板四角大方格中的细胞数,细胞压中线时,只计左侧和上方者,不计右侧和下方者。如果四个大方格细胞数之和大于,则用台盼蓝增加稀释倍数,重新计数。细胞计数公式细胞数毫升 硕士学位论文原液大格细胞数之和稀释倍数。计数后将细胞重悬在低糖培养液中,调整细胞密度至。实验分组及移植方法实验分组糖尿病下肢缺血大鼠模型例,随机分为组,分别为生理盐水肌注组组,生理盐水静脉输注组组,骨髓干细胞局部肌肉注射组、骨髓干细胞静脉输注组、人脐血干细胞局部肌肉注射组和人脐血干细胞静脉输注组。注射干细胞后继续喂养大鼠天。移植方法局部肌肉注射将骨髓干细胞或脐血干细胞分别制成浓度为的细胞悬液后,在左下肢沿血管走向选取个点,间距约“,肌肉注射细胞悬液,每个点注射约左右。静脉输注将骨髓干细胞或脐血干细胞分别制成浓度为的细胞悬液后,穿刺大鼠尾静脉注射细胞悬液糖尿病大鼠左下肢肌肉组织中血管内皮生长因子含量的检测双抗夹心酶联免疫吸附法注射干细胞周后,颈椎脱臼大鼠,切取各组大鼠左下肢肌组织亏于冰盐水中漂洗,去除血污,以干纱布浸干水分后,在电子天平上称湿重,称取,将标本剪碎,加入液,容器置于冰上,将肌组织用匀浆器研磨成匀浆,然后在℃下离心,取上清液,一℃保存备用。应用试剂盒检测的含量操作按说明书进行。糖尿病大鼠左下肢肌肉中毛细血管密度的测定从多聚甲醛中取出大鼠左下肢肌肉标本,脱水固定,石蜡包 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究埋,然后应用兔抗大鼠因子抗体标记位于血管内皮细胞,显示微血管数目,检测大鼠肌肉中微血管密度,其具体步骤如下石蜡包埋,切片,切片厚度为烤片℃二甲苯浸泡、二甲苯浸泡二甲苯浸泡、酒精浸泡酒精浸泡、酒精浸泡自来水洗液修复微波炉,高火,中低火,自然冷却、过氧化氢孵育、液冲洗,次滴加山羊血清工作液,室温下孵育巧,倾去,勿洗、加入己稀释好的兔抗大鼠硼因子抗体,亡下孵育℃下孵育过夜、℃下孵育液冲洗,次加入生物素标记的山羊抗兔抗体,℃下孵育液冲洗,次加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液,下孵育液冲洗,次二氨基联苯胺显色自来水充分冲洗苏木素复染盐酸浸泡、自来水充分冲洗、氨水浸泡、自来水充分冲洗电风吹吹干,中性树胶封片,晾干后观察。毛细血管密度用微血管密度来判断,用兔抗大鼠因子抗体的表达来标记血管内皮一,凡是染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数,凡管腔大于个红细胞大小、带有较厚肌层的血管区域的血管均不计数。具体方法为先在视野下找到微血管密度最高区域,然后在又视野下图像分析系统所取的视野每张切片随机选取个不重复视野,进行计数,取平均值作为该例大鼠的划万值。 硕士学位论文研究步骤流程图雄性大鼠只丰只大鼠提供骨髓干细胞雄性大鼠糖尿病下肢缺血模型的建立只告骨髓干细胞组脐血干细胞组空白对照组生理盐水肌注组只日尾静脉输注组只肌注组只尾静脉输注组只肌注组只日尾静脉输注组只含量毛细血管密度土一统计学分析一全部数据采用统计软件包进行分析。所有数据以均数士标准差妥士户表示。两组间比较采用检验,以认为差异有统计学意义。 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究第二章结果雄性大鼠诱导成糖尿病后的表现雄性大鼠造模后周血糖逐步升高,均在以上。在观察过程中,血糖稳定地保持在较高水平。糖尿病大鼠逐渐出现毛色灰暗、枯黄,杂乱,易激惹,皮肤变薄,多饮、多尿症状明显。糖尿病下肢缺血模型的表现己造模成功的糖尿病雄性大鼠,左侧肢体经血管结扎一天后,大鼠即出现食欲下降,缺血下肢逐渐出现萎缩,下肢活动力降低。所有动物在天后处死取材时局部均无明显坏疽。糖尿病大鼠死亡原因分析雄性大鼠只,糖尿病造模,成功例。进行下肢缺血造模,成模只,死亡只。死亡原因如下麻醉死亡只,伤口感染死亡只,低血糖死亡只,考虑死亡只。干细胞活性检测结果台盼兰染色干细胞,在光镜下观察干细胞的拒染率,干细胞活性均。干细胞移植后安全性分析脐血干细胞移植治疗的只大鼠中,未发现皮肤出血点、剥皮性皮炎等急性排斥反应症状,天后处死,心脏、肾脏、肝脏、脾脏、肺脏及皮肤肌肉组织未发现肿瘤样生长。 硕士学位论文糖尿病下肢缺血大鼠干细胞移植后左下肢含量表一骨髓干细胞移植后左下肢含量糖尿病下肢缺血大鼠进行干细胞移植后,左下肢含量骨髓干细胞肌注组较生理盐水肌注组明显升高,差异有统计学意义。骨髓干细胞尾静脉输注组较生理盐水尾静脉输注组左下肢含量明显升高,骨髓干细胞肌注组与尾静脉输注组比较,左下肢含量无明显差异。脐血干细胞移植后左下肢含量糖尿病下肢缺血大鼠进行干细胞移植后,左下肢含量脐血干细胞肌注组较生理盐水肌注组明显升高,差异有统计学意义。脐血干细胞尾静脉输注组较生理盐水尾静脉输注组左下肢含量明显升高尸,脐血干细胞肌注组与尾静脉输注组比较,左下肢含量无明显差异。干细胞肌注移植后左下肢含量糖尿病下肢缺血大鼠进行干细胞移植后,左下肢含量骨髓干细胞肌注组较生理盐水肌注组明一显升高,差异有统计学一意义。脐血干细胞肌注组较生理盐水肌注组左下肢含量明显升高尸,骨髓干细胞肌注组与脐血干细胞肌注组比较,左下肢含量无明显差异。干细胞尾静脉输注移植后左下肢含量糖尿病下肢缺血大鼠进行干细胞移植后,左下肢含量骨髓干细胞尾静脉输注组较生理盐水尾静脉输注组明显升高,差异有统计意义尸。脐血干细胞尾静脉输注组较生理盐水尾静脉输注组 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究含量明显升高一,。一骨髓干细胞尾静脉输注组与脐血干细胞尾静脉输注组比较,左下肢含量无明显差异。表一糖尿病下肢缺血大鼠干细胞移植后左下肢含量妥士、组分印生理盐水肌注组士生理盐水尾静脉输注组士骨髓干细胞肌注组士'骨髓干细胞尾静脉输注组肚'脐血干细胞肌注组士'脐血干细胞尾注静脉输注组士'注'与生理盐水肌注组比较,“与生理盐水尾静脉输注组比较糖尿病下肢缺血大鼠干细胞移植后左下肢毛细血管密度表一骨髓干细胞移植后左下肢毛细血管密度糖尿病下肢缺血大鼠进行干细胞移植后,左下肢毛细血管密度骨髓干细胞肌注组较生理盐水肌注组明显升高,差异有统计学意义尸。骨髓干细胞尾静脉输注组较生理盐水尾静脉输注组左下肢毛细血管密度明显升高,骨髓干细胞肌注组与尾静脉输注组比较,左下肢毛细血管密度无明显差异。脐血干细胞移植后左下肢毛细血管密度糖尿病下肢缺血大鼠进行干细胞移植后,左下肢毛细血管密度脐血干细胞肌注组较生理盐水肌注组明显升高,差异有统计学意义。脐血千细胞尾静脉输注组较生理盐水尾静脉输注组左下肢毛细血管密度明显升高尸,脐血干细胞肌注组与尾静脉输 硕士学位论文注组比较,左下肢毛细血管密度无明显差异。干细胞肌注移植后左下肢毛细血管密度糖尿病下肢缺血大鼠进行干细胞移植后,左下肢毛细血管密度骨髓干细胞肌注组较生理盐水肌注组明显升高,差异有统计学意义尸。脐血干细胞肌注组较生理盐水肌注组左下肢毛细血管密度明显升高,骨髓干细胞肌注组与脐血干细胞肌注组比较,左下肢毛细血管密度无明显差异。干细胞尾静脉输注移植后左下肢毛细血管密度糖尿病下肢缺血大鼠进行干细胞移植后,左下肢毛细血管密度骨髓干细胞尾静脉输注组较生理盐水尾静脉输注组明显升高,差异有统计学意义尸。脐血干细胞尾静脉输注组较生理盐水尾静脉输注组毛细血管密度明显升高。骨髓干细胞尾静脉输注组与脐血干细胞尾静脉输注组比较,左下肢毛细血管密度无明显差异尸。表一糖尿病下肢缺血大鼠干细胞移植后左下肢毛细血管密度妥士组分毛细血管密度个汪生理盐水肌注组士生理盐水尾静脉输注组士骨髓干细胞肌组士'骨髓干细胞尾静脉输注组士咪脐血干细胞肌注组士脐血干细胞尾注静脉输注组士注'与生理盐水肌注组比较,“与生理盐水尾静脉输注组比较 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究第三章讨论近年来,糖尿病发病率迅速上升,目前全球糖尿病患者已达亿,专家估计我国糖尿病患者已超过九千万。随着糖尿病发病率的上升,糖尿病足的发病率也明显上升。等认为约糖尿病患者会在其一生中发生糖尿病足溃疡。西方发达国家糖尿病住院患者中,糖尿病足占。我国住院的型糖尿病患者中,约有合并糖尿病足。糖尿病足是糖尿病最严重的并发症之一,严重者需要截肢甚至危及生命。我国糖尿病足溃疡多为血管性或混合性溃疡,改善下肢血供对糖尿病足的治疗起着决定性作用。干细胞移植能促进新生血管形成,改善局部血供,给糖尿病足的治疗带来了新的希望。寻找有效的千细胞来源,探索干细胞移植的可靠途径对糖尿病足干细胞移植治疗具有重要的理论和实践意义。脐血干细胞移植治疗的有效性和安全性脐血干细胞移植治疗的有效性本研究通过腹腔注射建立糖尿病动物模型,再经过结扎股动脉建立糖尿病下肢缺血模型,在缺血区域肌注或静脉输注脐血干细胞,结果显示在经脐血干细胞局部注射或静脉输注移植后,缺血左下肢的含量和毛细血管密度较生理盐水组明显升高尸。提示,脐血干细胞移植能有效改善糖尿病大鼠下肢缺血。等'研究人脐血单个核细胞通过肌注移植治疗鼠下肢缺血模型,其毛细血管密度明显升高。在临床上,等应用脐血间充质 硕士学位论文细胞肌注移植治疗,病,结果显示细胞移植后患者静息痛缓解、肢体皮肤溃疡周内愈合,血管阻力降低,血管造影显示肢体远端毛细血管密度增加、直径增大。有研究将从人脐血细胞诱导出的后,经尾静脉移植到后肢单侧缺血的裸鼠体内,缺血后肢的毛细血管密度、血流灌注及坏死程度均较对照组明显改善。这些研究与本研究均证实脐血干细胞移植能有效改善缺血局部的血供。我们通过对骨髓干细胞移植组与脐血干细胞移植组比较后,发现缺血左下肢的含量和毛细血管密度无明显差异。目前,骨髓干细胞移植治疗缺血性疾病在临床应用已取得了较好的效果,脐血干细胞移植治疗缺血性疾病的研究才刚刚起步。而且运用脐血干细胞时,一般是将脐血干细胞培养成内皮祖细胞或间充质细胞后再进行移植,直接用脐血单个核细胞移植治疗下肢缺血性疾病,特别是糖尿病足国内尚未见相关报道。而本研究的结果提示脐血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血大鼠可达到骨髓干细胞移植同样的效果。在脐血干细胞中,内皮祖细胞和间充质细胞要远远低于单个核细胞。如果使用内皮祖细胞和间充质细胞进行移植,要达到治疗效果的量,需在体外进行培养扩增,这使得感染及基因重排发生肿瘤的机会明显增加。本研究的结果提示,采用脐血单个核细胞移植治疗下肢缺血性疾病同样可以达到治疗的效果,从而避免了体外扩增培养可能产生的一系列问题。在脐血干细胞移植治疗的下肢缺血的糖尿病动物肌肉中,毛细管密度显著高于对照组尸,说明移植后的脐血干细胞促进了毛细血管的形成,其机制可能是其在移植部位部分分化为血管内皮细胞 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究犷`织乞探护廿,沁一,也可能与其表达血管内皮生长因子受体结合,促进了的趋化,使周围原有的血管内皮增殖有关。移植组肌浆中的含量显著增高,提示脐血干细胞治疗作用的机理可能与以下几点有关①脐血干细胞增强了的趋化作用,促进与其受体结合。②脐血干细胞分化为血管内皮细胞,新生血管增多,血供增加,使易于聚集于缺血部位,促进血管生成。③脐血干细胞移植后,改变了缺血的微环境,显著增加。脐血干细胞移植治疗的安全性本研究在未使用免疫抑制剂的情况下,巧只大鼠异种移植脐血干细胞后,在缺血局部的和毛细血管密度均高于生理盐水对照组,而且在移植后未观察到皮肤出血点、剥皮性皮炎等急性排斥反应症状。天后亦未出现上述症状。说明在异种移植脐血干细胞治疗糖尿病下肢缺血大鼠仍然有效,并且未出现明显的排斥反应。由于脐血干细胞移植是一种非自体细胞的移植,移植时免疫反应特别是免疫排斥的问题必需加以考虑,这对运用脐血干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的安全性非常重要。目前运用脐血干细胞治疗主要集中在血液系统疾病,相对于血液系统疾病来说,由于大量的放疗和化疗的预处理,其免疫被抑制,对相合的脐血干细胞来说,排斥不是主要问题。有研究报道,在非血缘及配型不完全相合的脐血干细胞治疗白血病仍有效。用脐血干细胞移植治疗中枢系统疾病时,由于大脑的血脑屏障限制了免疫细胞、细胞因子和免疫球蛋白的通过,使得免疫排斥反应发生缓慢, 硕士学位论文程度也较弱。等运用人脐血干细胞植入大鼠脑内,在未使用免疫制剂的情况下细胞能够生存、迁移。但对于下肢缺血性疾病,如糖尿病患者,年龄较大,常合并其他心血管疾病,不可能耐受长期应用免疫抑制剂所带来的副作用,而且在解剖学上也没有免疫学优势,这使得在治疗下肢缺血性疾病在免疫学角度有着更高的要求。本研究的结果进一步提示,脐血干细胞的抗原弱,免疫排斥反应低。其可能的原因是①脐血干细胞不成熟,其抗原呈递不理想,不足以刺激异种抗体的产生②可能脐血干细胞移植后抑制了细胞的增殖,一通过抑制细胞周期蛋白、活化周期蛋白依赖激酶抑制物阻断细胞分化进入期而抑制细胞的增殖③可能抑制淋巴细胞的增殖,通过上调细胞周期抑制性蛋白以及下调蛋白来抑制细胞的增殖④成体干细胞能较好的适应异种移植环境,而免疫抑制治疗可能不需要。也有研究认为是在移植的较早阶段即发生了受体供体嵌合现象,移植细胞和宿主细胞之间存在分子对话,调低了移植细胞表面的抗原表达,亦减弱了宿主的免疫反应。已有试验证明细胞移植后,移植的干细胞可下调宿主的免疫反应,并诱导嵌合体的形成,这有利用移植物的长期免疫耐受,,。而且在临床研究中,满勇等用多份脐血单个核细胞静脉移植治疗例老年期血管性痴呆患者,在未使用免疫制剂,细胞移植前后无并发症及不良反应发生,而且在随访一年的时间中,亦未发现排斥反应的发生。认为治疗时,虽然移植受体免疫及造血系统基本正常,仍可不进行人类白细胞抗原配型。理由是`①单个核细 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究胞相对含量高。②脐带血中细胞以旷亚群为主,占优势,生物活性低下,自然杀伤细胞高,但活性较低,故抗原性弱。③脐带血血清中细胞介素、肿瘤坏死因子表达水平低,可溶性白介素受体一表达水平高,说明脐带血血细胞免疫活性低下。④脐带血血清能显著刺激升高混合淋巴细胞培养的反应指数,但显著抑制无关个体混合淋巴细胞培养中人白细胞抗原的表达水平。干细胞静脉输注移植治疗的有效性和安全性干细胞静脉输注移植治疗的有效性『`一本研究在经尾静脉输注骨髓或脐血干细胞后,结果显示缺血左下肢和毛细血管密度骨髓或脐血干细胞尾静脉输注组较生理盐水尾静脉输注组明显升高尸,这说明用静脉输注移植干细胞的方式治疗糖尿病下肢缺血大鼠是有效的。在采用静脉输注干细胞移植治疗心肌梗死大鼠模型中,等将人脐血单个核细胞静脉输注到心肌梗死大鼠,发现在梗死心肌部位产生新生血管,移植后心功能明显改善。等和国内的胡承恒等也分别静脉输注人脐血来源细胞和单个核细胞,发现可在大鼠心肌中存活,并促进血管新生,从而改善心肌梗死大鼠心功能。记等通过静脉移植骨髓间充质细胞、骨髓单个核细胞治疗脊柱损伤模型,发现下肢运动功能的恢复情况显著高于生理盐水对照组。本研究也发现,在经静脉输注干细胞后,通过干细胞的“归巢”作用,能使缺血局部组织的和毛细血管密度增加。说明采用静脉输注移植干细胞是一种有效的治疗方式。我们发现,缺血左下肢的含量和毛细血管密度骨髓与脐血干细胞尾静脉输注组与骨髓或脐血干细胞肌注组无明显差异 硕士学位论文。说明采用静脉输注干细胞的方式同样可以达到肌注方式移植干细胞的效果,提示用静脉输注干细胞的方式可作为临床治疗糖尿病足的二种新手段。采用静脉输注的方式移植干细胞是一种操作简单治疗手段,相对于肌注干细胞,静脉输注干细胞不需硬膜外麻醉或腰麻。而且本研究的结果提示通过静脉输注干细胞具有与肌注法移植同样的疗效。这一结果为进行静脉输注移植干细胞的临床研究提供了理论依据。对于静脉输注干细胞的方式能使缺血区域的份和毛细血管密度增加,推测其可能的机制是①局部织组缺血缺氧,刺激干细胞进行归巢②干细胞通过旁分泌出细胞因子及生长因子,促进血管新生,③单个核细胞中的不同成分可能参与血管的修复,改善了缺血区血供网。④血管新生可以促进移植组织长期存活,抑制细胞凋亡干细胞静脉输注移植治疗的安全性本研究结果显示,在经静脉输注移植干细胞的巧只大鼠,观察天后,在其心脏一肾脏肝脏、脾脏、肺脏及皮肤肌肉组织未发现肿瘤样生长。提示采用静脉输注干细胞的治疗是安全的,未观察到致瘤性。大鼠的平均寿命一般是一年',人的寿命按岁算,本研究模型在干细胞移植后,观察天,相当于观察人年。由于本模型的限制,未能观察更长的时间。因而是否在观察更长的时间后,会引起肿瘤的发生仍需有待进一步的研究。静脉输注的方式是一种全身用药的方式,由于体内各个器官的微 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究环境不同,干细胞经血液循环进入这些器官后,在特定的微环境中是否会导致肿瘤的发生,这是应用静脉输注移植干细胞需考虑的一个重要问题。有研究经静脉途径移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠心肌梗死模型,移植周后处死大鼠,在心脏、肾脏、肝脏、脾脏及肺脏器官中未见肿瘤的生长。本研究也取得了一致的结果。小结目前,在运用干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的临床研究中取得了较好的疗效。但临床研究有着其特殊的局限,国内外主要是对一些主观指标如疼痛、麻木、冷感等和客观指标如踩肪比、经皮氧分压、无痛行走时间、血管造影、无痛行走时间、缺血性溃疡的改善等进行评价。在细胞分化、分子调控、乃至血管、神经等组织层次的问题有待进一步研究。在基础研究方面,干细胞是否能分化为新生血管、分化为什么结构成分等仍存在着争议。新生血管的作用是细胞为主还是细胞因子为主以及复杂分子调控机制的研究还尚未清楚。对干细胞移植的研究目前还刚刚起步。而且已有的动物实验模型大多用的是急性血管结扎模型,这也与糖尿病等疾病引起的慢性下肢缺血的病理生理机制有一定的差异。尽管如此,运用干细胞治疗促进血管新生,从根本上调整毛细血管、小血管、甚至中、大血管的微观结构与功能状态,有效改善血液循环,它为缺血性疾病、乃至更大范围的血液、血管相关疾病的治疗开辟了一个全新的思路。除了骨髓干细胞移植外,脐血干细胞移植治疗血管病的研究也日益增多。本研究采用静脉输注脐血干细胞的方式 硕士学位论文治疗糖尿病下肢血管病变,结果发现缺血下肢和毛细血管密度均增加,显示了其治疗作用。而脐血干细胞比骨髓干细胞、外周血干细胞有着其特有的优势,有着更为广阔的临床应用前景。 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究附图图糖尿病下肢缺血模型的建立生理盐水肌注组生理盐水尾静脉注组骨髓干细胞肌注组骨髓干细胞尾静脉输注组 硕士学位论文脐血干细胞肌注组脐血干细胞尾静脉输注组图各组毛细血管密度 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究结论脐血干细胞移植能增加糖尿病大鼠下肢缺血局部和毛细血管密度静脉输注干细胞能增加糖尿病大鼠下肢缺血局部和毛细血管密度静脉输注脐血干细胞可能成为糖尿病足下肢缺血治疗的有效途径。 硕士学位论文参考文献,,,」,,一黄蓉,夏宁,梁瑜祯干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的研究进展中国组织工程研究与临床康复,,一【,,,【」,,一」,,,·,,一【认厄,,,一」,,一,,,红,,一 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究,,,,,一【补刘丽,靖冬梅,王爱林血管内超声消融术治疗糖尿病足的疗效观察中华糖尿病杂志,一·网王体沛糖尿病足的外科治疗内科急危重症杂志,,一扭,,,一【〕郭连瑞,谷涌泉,张建,等不同途径移植骨髓单个核细胞治疗大鼠后肢缺血中国组织工程与临床康复,,一,,,,一【,,一「谷涌泉干细胞研究临床问答干细胞移植治疗下肢缺血性疾的安全性评价中国组织工程与临床康复,,【,,一,, 乒汤甲召`一`硕士学位论文一【,,,一一【」,,一」,,丫即一一,,一,,,一一,,一【郭连瑞,谷涌泉,张建,等自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足例报告中华糖尿病杂志,,一一」,,,,,一,,,一一, 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究【,,一〔,,,一,,一,,,一勿,,一,,,加,,一,,,,一,一,,一,,,」,,一,,,,一【〕王玉珍,许樟荣第五届国际血管外科暨第一届国际糖尿病血管疾病会议糖尿病足部分纪要中华糖尿病杂志,,一 硕士学位论文【,助,,,一【」中华医学会糖尿病学分会慢性并发症调查组一年全国住院糖尿病患者慢性并发症及相关大血管病变回顾性分析【中国医学科学院学报,,一,,一,,」,,,,,一,,,一,,,一〔杨晨,张志华,卢士红,等脐血内皮祖细胞移植改善肢体缺血的研究阴中华医学杂志,,一,,,形,」,,一」, 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究,一【」,,,一一【」,,【」高峰,蔡振杰,李利,等血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植促进缺血心肌血管生成的研究中国实用内科杂志,,一【」张蕾,陈沉,田杰,等骨髓间充质干细胞心肌样分化的微环境因素晦床心血管病杂志,,一,,,,,一工」,,,」,,一【」,,」,,一【」,笔,, 硕士学位论文,,一」,,一,,一,,,【,,一,,,,,一,,,,一,,,呷一笔,,一,,,,,一【」,,【」,,一【满勇,李建斌,马冀,等多份人脐血单个核细胞静脉输注移植治 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究疗老年期血管性痴呆例中国组织工程研究与临床康复,一」,,、乞,,,一」,,,一」,,、一、【」,,,一,,一【」胡承恒,伍富贵,王小庆,等`,人脐血单个核细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究中华心血管病杂志,,一」,一,一,一,,一几,,,一一一【」,,一,,,娜 硕士学位论文,,界,一【」,,,一,,一,,,【,一」,,,`,一〔施新酞医用实验动物学北京人一民军医出版社,一【孟玲,刘国树,曹丰,等经静脉途径移植骨髓间充质干细胞修复梗的可行性与安全性研究中华老年心脑血管病杂志,,一」,,,一」,,一 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究综述糖尿病足干细胞移植的机制研究新进展摘要干细胞在许多组织器官显示巨大的细胞分化潜能,其治疗糖尿病足成为当前研究的热点。已知局部缺血可诱导干细胞的动员,并能感受组织损伤而定向迁移到损伤区并进行分化,达到治疗的目的。本文就干细胞移植治疗糖尿病足,干细胞归巢机制作一综述。一关键词糖尿病足干细胞归巢随着我国人们生活水平的不断提高,糖尿病的发病率在快速增长,致使糖尿病足的发生率也越来越高。糖尿病足是糖尿病患者由于并发神经病变及各种不同程度末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和或深部组织的破坏,是导致糖尿病患者致残致死的严重慢性病发症之一。特别是对于糖尿病所致的下肢远端没有动脉流出道的糖尿病足患者,不管是传统的药物治疗,还是介入治疗,以及血管搭桥的办法,治疗效果都难取得满意,最终难以避免截肢的风险,因而寻求一种新的治疗方法尤为迫切。干细胞在一定条件下可诱导分化成为血管性内皮细胞,促进侧枝循环的建立,从而达到改善下肢血供的目的。干细胞移植治疗糖尿病足是目前研究的一个热点,而干细胞的归巢效果对治疗起着至关重要的作用,目前就对其做一综述。干细胞干细胞是指形成无性系和具有自我更新能力、能够分化为不同细 硕士学位论文胞谱系的细胞。用于移植的干细胞通常有以下几种造血干细胞,,骨髓单个核细胞,,内皮祖细胞,和间充质干细胞坤,,它们均有多向分化的潜能,可用于不同组织和器官的移植。干细胞与糖尿病性血管病变的发病机制由于干细胞能在局部环境的刺激下能分化内皮祖细胞,形成新生血管,因而成为治疗缺血性疾病的一种新方法一。糖尿病是一种以高血糖为主要表现的代谢性疾病,高血糖能促进血管病变而致器官组织缺血。而血管的变化是形成糖尿病血管病变的重要原因。减少和功能障碍与糖尿病并发症相关,导致糖尿病患者形成一系列微血管和大血管病变。有分化为成熟的内皮细胞并且参与新血管形成的能力。组织缺血后通过细胞因子和生长因子释放动员,一旦释放在周围血液循环里,缺血的部位将刺激形成代偿性的血管,。在糖尿病血管病变中的变化糖尿尿病时外周血数量明显下降,其增殖能力减弱,寿命缩短,迁移能力明显降低。在链脉佐菌素,诱导的糖尿病鼠天后,其外周血比非糖尿病对照组减少约,从外周血归巢到局部组织的能力也受损。另外,糖尿病鼠骨髓单个核细胞分化为能力也减少倍。糖尿病鼠在体外迁移和豁附能力受损,血管内皮生长因子和内皮型一氧化氮合酶的表达也显著 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究减少,且从骨髓动员和归巢到缺血组织也显著降低。与糖尿病血管并发症糖尿病血管病变具有高发病率、早期发展、两侧对称、迅速进展和典型的远端多部位损害的特点。糖尿病促进动脉粥样硬化不仅可致严重缺血性疾病,而且侧支血管形成能力也严重受损。大量的证据阴已表明在血管形成中起显著的作用,尤`其在创伤或缺血时通过刺激骨髓源性内皮祖细胞向外周迁移,提高外周的数量和活化程度,一促进血管新生,一从而改善血供。糖尿病患者血液中脱落内皮细胞的数量增加,随着内皮细胞的凋亡、脱落,机体进行骨髓动员,使移行至损伤内皮处进行修复。但在高糖环境下,的总数明显下降,而且糖尿病患者的增殖能力明显降低。由于内皮细胞受损可导致血管壁难以及时修复,动脉粥样硬化斑块易于形成,导致糖尿病患者侧支循环血管难以形成,最终导致重要肢体的缺血和糖尿病足的发生。干细胞在糖尿病血管病变的应用目前认为血管形成的机制有机体在缺血时会代偿性形成新生血管,这种血管新生有两种方式,即血管生成和血管形成。前者是指通过血管内皮细胞迁移、增殖,在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管后者是指在原来没有血管系统的情况下,通过和造血干细胞的移植以致分化和产生新的血管。目前认为促进新生血管形成的机制包括两个方面一方面是通过自身的分化增殖而形成新生血管,无需依赖原来的血管系统另 硕士学位论文一方面,本身可以分泌血管内皮生长因子等细胞生长因子,通过旁分泌效应促进局部血管内皮细胞增殖,即增强血管生成效应,从而改善供血。在临床和动物实验'“川的研究中,运用干细胞移植治疗糖尿病足,取得了良好的效果。但其归巢机制尚未完全清楚。干细胞归巢干细胞动员低氧可启动的活性,在机体组织缺血状态下,可从骨髓动员到外周血循环中,迁移至缺血部位并增殖、分化为新生血管。低氧时激活低氧敏感系统,低氧诱导因子一几,一是低氧系统的一个重要因子,对的动员有强烈的刺激作用。扭一是二聚体转录因子,由一和一亚单位构成。班一持续表达,一由细胞的氧浓度调节。在氧供充分条件下,班一经由泛素一蛋白酶体通路迅速降解。而细胞缺氧抑制了泛素一蛋白酶体的降解,允许班一和一二聚体化”,形成班一。由此产生的一结合到增强子区,提升了氧敏感系统基因编码的转录,其中包括血管内皮生长因子,、基质细胞衍生因子一,一和促红细胞生成素叩,,从而影响红细胞生成、血管发生、细胞凋亡和增殖等生理及病理过程,并使机体产生一系列的适应缺氧反应。而是机体内最主要的血管生长因子,对的动员及促进血管新生有着极其重要的作用。是内皮细胞有丝裂特异性诱导因子,能诱导骨髓源性内皮 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究前体细胞活化,并从骨髓进入血循环中,增强血管新生'。生物学效应均是通过其特异性受体受体,介导来实现的。一、一是的受体',这两种受体主要分布在内皮细胞上'。结合至内皮细胞的受体细胞外区的结构域上,弓起细胞内激酶区特定酪氨酸残基的磷酸化而活化,其中,主要是位于激酶插入区的和梭基末端的。的自磷酸化导致了磷脂酶依次刺激一一旁路,一活化促分裂原活化蛋白激酶,。叭作为转录因子可转运至细胞核内,启动特定基因的表达,完成相应的促增殖作用。而自磷酸化后,结合信号分子细胞专一结合体,并使后者发生酪氨酸磷酸化,接着联系细胞质酪氨酸激酶,调整肌动蛋白张力丝的结构,并使内皮细胞根据的浓度梯度而迁移。等“给小鼠腹腔注射可溶性,每天次,连续周,结果发现,处理组小鼠在接受治疗的第天,循环数为未处理组的,第天达高峰值,为未处理的,到第天仍为未处理组的,研究者还发现能动员更多的参与受损角膜新生血管形成,并证明了动员的循环来源于骨髓。而且多种促血管生长因子如间质细胞源性因子、肿瘤坏死因子等通过增强的表达起作用`,一。另外,其他因子如粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子一、干细胞因子和粒细胞集落刺激因子一等它们不仅能动员造 硕士学位论文血干细胞仁',也能动员并促进缺血组织的新生血管形成。干细胞迁移干细胞的迁移是由与迁移有关的网络庞大复杂的趋化因子共同完成的,目前研究主要涉及基质细胞源性细胞因子一几一,一及其受体一轴、肝细胞生长因子,及其受体一一轴以及各种细胞生长因子等。一`轴一正常情况下主要由骨髓基质细胞释放,确保向骨髓的趋化豁附。一又名或前细胞刺激因子印一仃几,,属于族趋化因子成员,同基因编码两种蛋白一和一。一主要在骨髓基质细胞及骨髓内皮细胞表达。一唯一的受体,是一个有个跨膜结构域的蛋白祸联的受体,在造血干祖细胞表面及内皮祖细胞表面高度表达二等发现一介导的趋化反应是由细胞表面的表达水平所决定,表达量越高对一诱导发生的迁移细胞越多。等用体外扩增的做一诱导的迁移实验,发现一对有强大的趋化活性,这种趋化活性呈浓度依赖性,表明表达的就能够沿着的浓度梯度迁移实现归巢过程。但经抗体孵育后的干细胞无法实现归巢过程,表明造血干祖细胞的植入是依赖于造血干祖细胞表面表达的。 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究有研究发现,纯化的造血干祖细胞迁移到表达一的基质细胞构成的微环境,而不对其他任何已知的趋化因子产生响应,提示一之间的特异性作用在实现植入方面可能起着不可替代的作用。最近的研究表明在缺血组织和损伤血管的平滑肌也有一的强表达一。总之,一系统参与造血干祖细胞、内皮祖细胞等细胞的趋化和迁移,对维持造血系统、心血管系统功能等方面起重要作用。肝细胞生长因子活化的成纤维细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞等均可表达。正常心脏低水平表达及其受体一,大鼠冠脉闭塞后上调达以上,能增加心肌细胞在缺血氧化应激环境下的存活率,减少凋亡。而且,梗死心肌内基因治疗或转染的从均可促进血管新生和心脏收缩功能的改善。临床一动员前骨髓单个核细胞细胞数量和血浆水平呈负相关,可能与骨髓基质细胞产生促进的骨髓勃附、增殖和存活有关。可为缺血心肌区创造利于干细胞豁附定植的微环境,从而用于心肌再生治疗。另外,在心脏干细胞也能表达一和胰岛素样生长因子一一受体,合成分泌相应的配体和一,在区和一局部注射可促进内源性的移行归巢。干细胞的豁附、分化在干细胞的表面存在着整合素的受体,整合素在血管新生的内皮细胞的增殖、分化中起到重要的作用。整合素是广泛分布于细胞表面 硕士学位论文的跨膜糖蛋白受体,是由、两个亚单位通过非共价键连接而组成的异源二聚体。整合素的主要功能是勃附和信号传导,介导细胞、基质之间的相互作用,参与调节细胞的勃附、增殖、分化、血管发生等一,”,其作用依赖于,离子。整合素与的粘附和迁移涉及到干细胞在体内激活血管新生组织的归巢,如和嘶整合素涉及到在缺血组织中的归巢。这与民整合素在造血干细胞造血祖细胞上表达相一致,民整合素介导造血干细胞造血祖细胞的粘附和迁移,【'。整合素表达在外周血来源的,并且需要粘附到上和跨内皮迁移。如造血干细胞一一缺乏陇整合素,在缺血后组织则只有有较弱的归巢作用和促进血管新生作用。总之,干细胞的归巢过程是个庞大复杂的过程,是各种因子相互影响,相互作用,共同完成的结果。干细胞治疗安全性在动物实验和临床试验中,自一体干细胞移植短期内均未发现明显的不良反应和严重后果。。及等一,,发现,移植后血清肌酸磷酸激酶达到最高峰,但最大范围不超过正常的倍,以后均下降到正常水平,未发现有注射部位的局部炎症反应、水肿及其他不良事件。等冈用一动员外周血十祖细胞移植后发现祖细胞能与淋巴细胞的交互作用抑止自然杀伤细胞的增生,导致机体的免疫缺陷,但自体外周血干细胞移植长时期是否会产生严重的不良后果还没有充分的临床证据。自来谷涌泉教授等了国 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究内首例自体骨髓以来移植,加上采用的外周血干细胞移植技术,己经治疗了例患者。目前全国范围内行干细胞移植治疗下肢缺血疾病患者的总数已经突破例,均未发现肿瘤或血管瘤的发生。干细胞移植治疗时日较短期,尽管目前的研究是安全有效的,但它的长期安全性还需有待进一步观察。展望干细胞的广阔应用前景证明它将作为一种新的治疗手段出现在心血管疾病的治疗方法一中,对于终末期下肢缺血避免截肢,梗死·后心肌的功能恢复,肺动脉高压,支架移植后再狭窄等难治性心血管疾病的治疗有着重要意义,也将为肿瘤的定向治疗开辟新途径。随着干细胞的表型鉴定,数量扩增等应用过程中的问题的解决必将为提高心血管疾病的整体治疗水平奠定基础,为广大血管疾病患者带来新的希望。 硕士学位论文参考文献【【,,一一,,,·【,一,一【,一」,,一【,,,一一,,一一【,,几一,·一勿【」,,一,,,一」,,一 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究,,邓,。笔,,一,,,,,【」,,一【」长,,即笔以,一,,一一【」`,,一【张玉浩,戴坤扬,梅家才血管内皮生长因子联合骨髓单个核细胞自体移植拾疗大鼠一肢体缺血中国组织工程研究与临床康复,,一」,,一一,,一,,,即 硕士学位论文,,一一」,,一,,,一」,,一,,一」,,,一一一一,,一【」,,一,,一」,,,叮一 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究」,,一」,,,一一【」,,一」,一,,一一,,一二」,,,,,名一【」,,,,,一,,,【,,一,,, 硕士学位论文一一【,,一【,,,娜,,一`,,,一叮一,一」,,一【,,,,,【,,一,',,【」,,一【,,,一一,,一【,,,一 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究旧,,一」,,,一』,,一,,,一一,,一,,,别叮,,一谷涌泉干细胞研究临床问答干细胞移植治疗下肢缺血性疾的安全性评价中国组织工程与临床康复,, 硕士学位论文主要缩写词表,缩略语英文全称中文名称﹃﹄,沦︺微血管密度脐血干细胞骨髓干细胞外周血干细胞血管内皮生长因子糖尿病足一叮一粒细胞集落刺激因子毗单个核细胞内皮细胞内皮祖细胞链脉佐菌素磷酸盐缓冲液 脐血干细胞移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血的实验研究致谢“饮其流时思其源,成吾学时念吾师。”至此论文完成之际,衷心感谢导师张娜教授、张弛副主任医师在我三年的研究生学习和工作期间过的谆谆教诲、精心指导和热情关怀。导师渊博的知识、崇高的品德、高超的医术、严谨的治学态度和对事业的执着追求精神,永远是我学习的楷模和追求的目标。衷心感谢李华珠主任医师、杨晓春副主任医师、周桂莲副主任医师、王敏老师、熊璞老师、吴文宇老师以及内分泌科全体医护人员对我学习和工作的无私帮助和热情关怀。衷心感谢临床研究所曹友德老师、石泳中老师、聂盛丹老师、李淑芳老师、梁珊老师、范莎莎老师、黄韧老师对我实验的关心和大力帮助。衷心感谢产科姚穗主任以及全体医护人员在采集脐血中给予的热情帮助。衷心感谢科研科袁友红科长、郑妓老师以及其他老师对我的培养和帮助。衷心感谢我的同学刘瑛、李大品、田政湘、何计南、邓婷智、高菊华、张华成、胡冀、王进、彭玲对我实验的大力支持和帮助。衷心感谢师弟师妹们的无私帮助和通力合作。衷心感谢我亲爱的父母给予我的关心、资助和支持。再一次感谢所有帮助和关心过我的老师和同学。 硕士学位论文在读期间发表的主要学术论文及参与课题一、发表学术论文肖日军,张弛对冠心病患者的影响中国社区医师杂志,,月二、参与课题糖尿病足干细胞移植基础及临床研究一一湖南省人民医院仁术基金创新项目腺普脱氨酶基因多态性与代谢综合征的关系研究一一湖南省人民医院仁术基金一般项目强化胰岛素治疗对型糖尿病患者内皮祖细胞功能的影响及其机制研究一一湖南省卫生厅保健专项资金科研重点课题 湖南师范大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。位`文`作“`洲勃`。年月沙日湖南师范大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密国,在不保密口。兰年解密后适用本授权书。请在以上相应方框内打“了”作者签名日期劫。年二月`矛日导师签名日期以。`。年丁月`了日