人脐血间充质干细胞移植治疗dcm大鼠的实验研究

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1、湖南师范大学硕士学位论文人脐血间充质干细胞移植治疗DCM大鼠的实验研究姓名：罗建红申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：何学华201204摘要『IIIJJIlllIJIIl／／lllll／lllllJJIIIl／llllllllY2147330目的：应用腹腔注射阿霉素建立扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)Wistar大鼠模型⋯，培养扩增人脐血间充质干细胞(humanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcells，HUCB-MSCs)，流式细胞术(flowcytometry，FCM)鉴定为间充

2、质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)后，经尾静脉移植HUCB．MSCs到DCM大鼠，观察心肌内HUCB．MSCs的定植情况及其对DCM大鼠心肌病理积分、LVEF和血浆脑钠肽(Brainnatriureticpeptide，BNP)的影响，免疫荧光及免疫组化染色检测大鼠心肌组织中HUCB-MSCs的心肌肌钙蛋白T(CardiacTroponinT，cTnT)的表达，以探讨HUCB．MSCs移植后改善DCM大鼠心功能的作用机制。方法：将100只Wistar大鼠随机分为正常对照组(简称正常组，n=10)和实验组(n=90)。实验组参照文

3、献建立DCM模型，并将成功建模的46只实验组大鼠随机分为DCM对照组(简称对照组，n=23)、DCMHUCB．MSCs治疗组(简称治疗组，n=23o在无菌条件下取健康产妇分娩胎儿时的脐带血，利用密度梯度法分离脐血单个核细胞(mononuclearcells，MNCs)，贴壁法培养进行原代培养并传代到第三代(P3)以获取HUCB—MSCs。取P3代细胞分别通过流式细胞仪(flowcytometry，FCM)检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CDl05以鉴定为HUCB．MSCs，T应用台盼蓝染色计数HUCB．MSCs数量并计算活细胞率；然后应用5

4、．溴脱氧尿嘧啶(5．Bromo．2．deoxyUridine，Brdu)标记HUCB—MSCs后，检测Brdu标记率，先后两次(间隔2周)经尾静脉注射到治疗组大鼠体内。4周后对各组大鼠进行病理检查计算病理积分：超声心动图评价LVEF，ELISA法检测大鼠血浆BNP；应用免疫组化和激光共聚焦细胞仪(1aserscanningconfocalmicroscope，LSCM)检测Brdu标记的HUCB—MSCs表达cTnT的情况。结果：1．所获取的HUCB．MSCs的鉴定及标记结果：应用贴壁法培养获取的HUCB．MSCs经台盼兰实验测定活细胞率>95％；应用F

5、CM检测显示其稳定地高表达CD29、CDl05(分别为93．37％、89．08％)；而微弱表达CD34、CD45(分别为O．89％、1．06％)。HUCB．MSCs应用终浓度lOlxmol／L的Brdu标记72h后的标记率为87％。2．治疗后正常组、对照组和治疗组大鼠心肌病理积分、LVEF和血浆BNP的变化：①治疗组治疗4周后心肌病理积分(O．824-0．37)与治疗前(1．17j：0．81)以及对照组(1．62+0．64)相比均明显降低，差异均有统计学意义(P

6、组治疗后LVEF(62．36+4．72)与治疗前(40．02土2．04)以及对照组(32．52-4-4．42)相比较，均明显好转，其间差异有统计学意义(尸

7、CB．MSCs在心肌中的定植及分化的结果：①免疫组化染色可见治疗组大鼠心肌中Brdu标记的HUCB．MSCs散在分布，细胞核为棕黄色，胞质中可见棕黄色肌原纤维结构；②激光共聚焦细胞仪观察治疗组心肌组织HUCB．MSCs表达cTnT的情况，可见Brdu标记的HUCB．MSCs散在分布呈(红色)，其表达的cTnT呈、(绿色)，细胞核为蓝色。结论：1、人脐血经密度梯度离心后应用贴壁法培养可获得足量可靠的HUCB．MSCs，其表达的表面抗原符合MSCs的特征。2、应用HUCB．MSCs移植治疗DCM大鼠可明显改善心肌病理损伤，提高LVEF，降低血浆BNP，有明显

8、改善DCM大鼠心功能的作用。3、经尾静脉移植的HUCB．MSCs散在分布于DCM