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1、HPLC法测定恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量恒古骨伤愈片是由中成药恒古骨伤愈合剂(收载于《国家中成药标准汇编骨伤科分册》)改变剂型而制成的新制剂[1],药味由陈皮、红花、三七等9味中药组成,具有活血益气、补肝肾、接骨续筋、消肿止痛、促进骨折愈合的功效,用于新鲜骨折及陈旧骨折、股骨头坏死、骨关节病、腰椎间盘突出症等。为控制本品的质量,本试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定了恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量,作为其内在质量控制指标之一。 1仪器与试药 日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪；SPD-10A紫外检测器；KQ-250型超声波处
2、理器。建筑论文发表 橙皮苷对照品购于中国药品生物制品检定所(批号1107221-200211,HPLC面积归一化法,测定含量为99.99%)；恒古骨伤愈片由吉林万德制药有限公司提供(批号20080401,20080402,20080403,20080501,20080502,20080503,20080504,20080505,20080506,2008057)。其他所用化学试剂均为国产AR级。 2方法与结果 2.1色谱条件色谱柱：Shim-pack-C18(4.6mm×150mm,5μm)；流动相为乙腈-0.4%磷酸水(
3、20∶80)；流速：1mL/min；紫外检测波长：283nm；理论塔板数按大黄素计算不低于5000；柱温为室温[2]。 2.2对照品溶液的制备精密称取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL约含0.05mg的溶液,即对照品溶液。 2.3供试品溶液的制备取本品20片,研细,取约0.3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声提取(功率180in,取出,放冷,再称定重量,加甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。 2.4阴性对照溶液的制备 按处方量制备不含陈皮药材的阴性样品,按供试
4、品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL,注入液相色谱仪中,按上述色谱条件测定。结果表明,阴性对照溶液色谱图中与对照品相应位置处无干扰,此法可行(见图1)。建筑论文发表 2.5线性关系考察 精密称取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1mL含橙皮苷0.0485mg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20μL注入高效液相色谱仪,记录色谱图,测定其峰面积。以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归,得到回归方程为：Y＝1008770.377X＋25623.859,r＝0.
5、9999,结果表明,橙皮苷在0.194～0.970μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。2.6精密度试验精密吸取供试品溶液连续5次重复进样,测得橙皮苷峰面积RSD＝0.57%。 2.7稳定性试验精密吸取供试品溶液在0、2、4、6h分别进样,进行测定。结果橙皮苷峰面积RSD＝0.47%,表明在6h内供试品溶液中橙皮苷含量稳定。 2.8重复性试验精密称取同一批号样品5份,按供试品溶液的制备方法制备,依法进样分析,结果样品中橙皮苷含量RSD＝0.50%,表明其重复性良好。 2.9加样回收率试验精密称取橙皮苷对照品适量,加入到
6、已测知橙皮苷含量的恒古骨伤愈片样品(批号20080401,橙皮苷含量3.0815mg/g)中,精密加入甲醇50mL,称定重量,超声提取30min,取出,放冷,再称定重量,加甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,制得供试品溶液,进样5μL,测定并计算回收率。结果平均回收率为98.5%,RSD＝0.63%。见表1。表1加样回收率试验结果（略） 2.10样品测定 按上述方法,制备供试品溶液,测定10批恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量。测定结果表明,恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量基本稳定,暂定为每片含橙偿皮苷含量不得少于1.40mg。结果见表2。表
7、2恒古骨伤愈片中橙皮苷含量测定结果（略） 3讨论 有关橙皮苷的HPLC含量测定方法较多,流动相采用乙腈、甲醇、水、冰醋酸等系统[3-4]。我们通过摸索,采用乙腈、磷酸水系统,色谱分离效果较为满意,分离度及峰形对称性较好。待测成分橙皮苷易溶于甲醇,故采用甲醇溶剂提取。对供试品提取方法的考察采用加热回流提取和超声提取,测定结果分别为3.812、3.810mg/g,两种方法制得的供试品中橙皮苷含量无差异,均可使橙皮苷提取完全。为了简化操作,故选用超声提取制备供试品溶液。本试验对超声提取时间进行了考察,分别以20、30、40min进
8、行超声提取,测定结果分别为3.652、3.811、3.813mg/g,超声提取30min以上,可使橙皮苷充分浸出,为了缩短检测时间,故确定超声提取时间为30min。
