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1、糖皮质激素对哮喘豚鼠模型Eotaxin、CCR3表达的调控：吕丽丽,朱述阳,刘平莉【摘要】 目的:观察哮喘豚鼠外周血、肺和骨髓组织嗜酸性粒细胞（EOS）百分比和肺组织Eotaxin和CCR3的表达及激素对其影响。方法:健康雄性豚鼠40只,以卵白蛋白（OVA）致敏和激发制作哮喘模型,随机分为正常组（A组）、哮喘组（B组）、地塞米松干预组（C组）、布地奈德干预组（D组）,每组10只,在末次激发6h后处死豚鼠;取豚鼠颈动脉血、骨髓和肺组织,分别制备血涂片、骨髓涂片和肺组织切片;外周血和骨髓涂片用）购自天津药业焦作有限公司。布地奈德混悬液（BUD）购自无锡阿斯利康制药有
2、限公司。奥林巴斯图像采集系统、百瑞雾化器。 1.2方法 1.2.1哮喘模型的建立参照Dandurand等［1］方法制作。哮喘组豚鼠腹腔注射OVA100mg和Al（OH）3200mg混悬液1mL致敏。2周后将已致敏豚鼠置于自制雾化玻璃箱（20×30×40）cm中,用10g/LOVA雾化吸入诱发,每次5只,约20min,以出现口唇发绀、呼吸急促、烦躁等为止,1次/d,连续5d。正常对照组豚鼠腹腔注射生理盐水1mL,2周后予生理盐水雾化吸入1次/d,吸入时间为同批哮喘组诱喘最长时间。 1.2.2实验分组将健康豚鼠随机分为正常组（A组）、哮喘组（B组）、DXM干预（
3、C组）、BUD干预组（D组）,每组10只。A组和B组每次诱喘前1h腹腔注射生理盐水1mL,C组每次诱喘前1h腹腔注射DXM（1mg/kg）（生理盐水稀释为0.2g/L）,D组每次诱喘前1h用喷射雾化器吸入BUD溶液0.2mg。于第5天激发后6h,处死豚鼠取材作相应测定。 1.2.3标本制备于末次激发后6h,用100g/L水合氯醛麻醉（2.5mL/kg）动物后,剖开胸腔,取颈动脉血约1mL涂片。取右侧股骨,去掉两端骨骺,用0.2mLPBS液冲洗骨髓腔,采集冲洗液涂片。外周血和骨髓涂片晾干后用g组织加6μL尿素裂解缓冲液［7mol/L尿素、2mol/L硫脲、65mm
4、ol/L二硫苏糖醇、40g/L3［3（胆酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸盐（CHAPS）、10g/L蛋白酶抑制剂（cocktail）］,置冰上1h,每15min涡旋1次,以10000r/min4℃离心1h,取上清夜分装于-70℃保存。按Loin,按Pei等［3］方法,每孔150μg蛋白量加样,经100mL/LSDSPAGE分离后,以湿转移法转至NC膜上,加入30g/L封闭液,室温封闭3h;分别单独加入一抗（抗Eotaxin多克隆抗体1∶100）,4℃过夜,洗涤缓冲液（in×3次;加入相应的碱性磷酸酶（AP）标记二抗,室温孵育2h,in×3次;加入显色剂（NBT/
5、BCIP显色试剂盒）,反应达到要求后流水洗涤终止反应。以鼠βactin作内参照。 1.2.6统计学分析实验数据采用Sigmaplot作图软件及SPSS13.0统计软件分析,数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,两两比较采用q检验,研究结果相关性采用Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。 2.2各组外周血、骨髓和肺组织EOS计数B组外周血、骨髓和肺组织EOS百分比明显高于A组（表1）,两组比较有统计学意义（P<0.05）。C组外周血、骨髓和肺组织EOS百分比较B组有显著性下降,两组比较有统计学意义（P&l
6、t;0.05）,但仍高于A组（P<0.05）。D组外周血、骨髓和肺组织EOS百分比较B组有显著性下降,两组比较有显著性差异（P<0.05）,但仍高于A组（P<0.05）。C组与D组比较差异无统计学意义（P>0.05）,但C组较D组降低骨髓EOS似乎更明显。 图1各组豚鼠肺组织病理形态学改变（HE,×400）（略） A:正常组;B:哮喘组;C:DXM组;D:BUD组. 表1豚鼠外周血、骨髓和肺组织EOS百分比（略） aP<0.05vs正常对照组;cP<0.05vs哮喘组. 2.3各组肺组织Eotaxin、CCR3免疫组织
7、化学染色结果分析A组部分支气管、细支气管上皮细胞Eotaxin、CCR3呈弱阳性表达,肺泡区阳性细胞数很少;B组Eotaxin、CCR3主要表达于支气管上皮细胞,支气管上皮细胞呈强阳性表达,部分平滑肌细胞、肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞也有一定程度呈弱阳性表达,嗜酸性粒细胞及部分淋巴细胞等炎性细胞也有表达,阳性明显强于A组;C组和D组表达相对于哮喘组均有不同程度的减轻。B组肺组织Eotaxin、CCR3阳性细胞百分比明显高于A组（表2）,两组比较有统计学意义（P<0.01）;C组肺组织Eotaxin、CCR3阳性细胞百分比较B组有显著性下降,两
8、组比较有统
