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1、CCR3在哮喘豚鼠模型肺和骨髓中的表达及意义【摘要】目的观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织嗜酸粒细胞趋化因子受体3（CCR3）及嗜酸粒细胞（EOS）不同时相表达的变化,探讨哮喘发病的可能机制。方法用卵白蛋白(OVA)和生理盐水致敏法制备豚鼠哮喘和对照模型,分为正常对照组（N）及哮喘组（A、B、C、D、E），每组8只，于激发后30min，6h，12h，24h，48h处死，瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例,免疫组织化学技术检测骨髓中CCR3的表达；制备豚鼠肺组织病理标本,苏木精-伊红染色,免疫组化检测肺组织中CCR3的表达。结果①哮喘组
2、骨髓和外周CCR3及EOS表达明显增加；②OVA激发后,骨髓和外周CCR3及EOS表达：30min变化不明显，6h，12h达到峰值，24h开始下降，48h恢复正常水平；③骨髓的变化早于外周，CCR3的表达早于EOS的增多，且CCR3和EOS呈线性相关。结论哮喘豚鼠肺组织和骨髓之间存在骨髓EOS细胞到循环再到肺组织的通路，CCR3表达增强,为EOS从骨髓快速募集到肺组织提供了可能。【关键词】支气管哮喘CCR3EOS骨髓豚鼠Abstract:ObjectiveToexplorethepathogeicmechanismofasthmaby
3、trackingtheexpressionsofCCR3andEOSinlungtissueandbonemarroaticmodels.MethodsGuineapigs(GP)aticmodel(groupsA,B,C,DandE).ThecontrolGP(groupN)in,6h,12h,24hand48hafterthechallenge,peripheralbloodandbonemarroberandpercentageofEOS.TheexpressionofCCR3inbonemarromunohistochemis
4、try.Results①ThetotalcountsofEOSandtheexpressionofCCR3inbonemarroamodelsthanincontrols.②Afterthechallengeainedinthenormalrangeat30min,begantoriseandreachedthepeakat6hand12h,foundtobedecreasedat24handreturnedtonormalby48h.③ThebonemarroentofEOSandtheytarrocellstomovetothec
5、irculatingbloodtothelungtissue.TheincreaseofCCR3expressionentofEOSfrombonemarroa;CCR3;EOS;bonemarroin,OVA,美国Sigma公司)、CCR3多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒(武汉Boster公司)、奥林巴斯图像采集系统、德国百瑞雾化器和自制雾化箱。1.2方法1.2.1哮喘模型的建立哮喘组于第1天腹腔注射抗原混悬液1ml(OVA100mg、氢氧化铝200mg),2周后将豚鼠放于自制雾化吸入箱内,喷射雾化吸入10g/LOVA20min,
6、连续5天［1］。对照组于第1天腹腔注射1ml生理盐水,2周后喷射雾化吸入生理盐水20min,连续5天。最后1次雾化吸入后，哮喘组A、B、C、D、E分别于30min，6h，12h，24h，48h处死动物,对照组12h处死，取材并作相应测定。1.2.2骨髓和外周血EOS计数于末次激发后,断颈处死豚鼠,取颈动脉血制作血涂片。取两侧股骨,去掉两端骨骺,剖开骨干髓腔,以含肝素100U/ml的生理盐水溶液将骨髓细胞冲洗出,4℃,1000r/min离心5min后，沉渣涂于多聚赖氨酸处理的玻片上，干燥后以40g/L多聚甲醛固定30min,-20℃保存
7、备用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色,随机计数200个白细胞,并计算其中EOS百分比。1.2.3骨髓细胞CCR3表达的检测采用SABC免疫组织化学法检测骨髓中CCR3的表达。以兔抗大鼠CCR3IgG为一抗,以生物素化的羊抗兔IgG为二抗。取骨髓沉渣涂片,按SABC免疫组化试剂盒说明书处理。在光镜下观察结果,胞膜为棕黄色者为阳性细胞,在光镜(×400)下随机选取5个视野,计数阳性细胞数占白细胞总数的比例,结果以±s表示。1.2.4肺组织EOS计数及CCR3表达的检测无菌操作下切取部分肺组织,40g/L多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,分别进
8、行H-E染色、CCR3免疫组化染色(严格按武汉Boster公司SABC试剂盒说明书操作)。肺组织切片H-E染色后,每张切片计数200个细胞,计算其中EOS百分比。免疫组化计数方法:光镜下观察胞膜着棕黄色为阳性细胞。每例选
