哮喘豚鼠模型肺和骨髓中ccr3及cd34的表达及意义

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1、哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表达及意义：陈德忠,付国昊,朱述阳,吕丽丽赵传云【摘要】目的:观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织CCR3及EOS不同时相表达的变化,探讨哮喘发病的可能机制。方法:用卵白蛋白(OVA)和生理盐水致敏法制备豚鼠哮喘和对照模型,分为正常对照组（N）及哮喘组（A、B、C、D、E）,每组8只,于激发后30min,6h,12h,24h,48h处死,瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例,免疫组织化学技术检测骨髓中CCR3及CD34蛋白的表达;制备豚鼠肺组织病理标本,苏木精伊红染色,免疫组化检测肺组织中CCR3和CD34的表达。结果:(1)哮喘组骨

2、髓和外周CCR3与CD34及EOS表达明显增加;(2)OVA激发后,骨髓和外周CCR3、CD34及EOS表达:30min变化不明显（肺内CD34表达增加）,6h（肺内CD34表达下降）、12h达到峰值,24h开始下降,48h恢复正常水平;(3)骨髓的变化早于外周,CCR3的表达高峰早于CD34表达与EOS的增多高峰,且CCR3、CD34和EOS互呈线性相关（肺组织内除外）。结论:哮喘豚鼠肺组织和骨髓之间存在骨髓CD34＋祖细胞、EOS细胞到循环再到肺组织的通路,骨髓和肺组织CCR3表达增强,为CD34＋细胞、EOS从骨髓快速募集到肺组织提供了可能。【关键词】支气管哮喘;CC

3、R3;CD34;骨髓;豚鼠哮喘是多种细胞（如嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道炎症性疾患,哮喘气道炎症的特征性改变为嗜酸粒细胞（EOS）的浸润和活化。气道黏膜下的EOS主要于骨髓CD34+干细胞在某些细胞因子(如eotaxin,IL5)的诱导下分化成熟为EOS,释放入外周血,在多种趋化信号的引导下向肺内定向募集。这一现象意味着从骨髓循环气道,存在着调控EOS及其祖细胞定向迁移的信号通路。趋化因子eotaxin对EOS有高度的特异性,其受体3(CCR3)在EOS膜上大量存在,且与eotaxin有高度亲和性,eotaxin是强

4、有力的EOS趋化剂,eotaxin和CCR3在哮喘发病机制中起重要作用。本实验我们探讨哮喘发作时骨髓和气道之间的调控EOS定向迁移信号通路;通过研究CCR3及CD34的表达,分析CCR3及CD34的改变对EOS在骨髓增殖分化及其在肺组织趋化和浸润的调节作用,为临床开发治疗哮喘新方法提供理论依据。1材料和方法1.1材料雄性豚鼠48只,体质量(250±50)g,由徐州医学院动物中心提供。随机分为对照组（N）、哮喘组(根据处死时间分为A、B、C、D、E组),每组8只。鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA,美国Sigma公司)、CCR3、CD34多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒

5、(武汉Boster公司)、奥林巴斯图像采集系统、德国百瑞雾化器和自制雾化箱。1.2方法1.2.1哮喘模型的建立哮喘组于第1天腹腔注射抗原混悬液1mL(OVA100mg、氢氧化铝200mg),2周后将豚鼠放于自制雾化吸入箱内,喷射雾化吸入10g/LOVA20min,连续5d［1］。对照组于第1天腹腔注射1mL生理盐水,2周后喷射雾化吸入生理盐水20min,连续5d。最后1次雾化吸入后,哮喘组A、B、C、D、E分别于30min,6h,12h,24h,48h处死动物,对照组12h处死,取材并作相应测定。1.2.2骨髓和外周血EOS计数于末次激发后,断颈处死豚鼠,取颈动脉血制作血涂

6、片。取两侧股骨,去掉两端骨骺,剖开骨干髓腔,以含肝素1667μkat/L的生理盐水溶液将骨髓细胞冲洗出,4℃,1000r/min离心5min后沉渣,涂于多聚赖氨酸处理的玻片上,干燥后以40g/L多聚甲醛固定30min,-20℃保存备用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色,随机计数200个白细胞,并计算其中EOS百分比。1.2.3骨髓细胞CCR3、CD34表达的检测采用SABC免疫组织化学法检测骨髓中CCR3、CD34的表达。以兔抗大鼠CCR3IgG为一抗,以生物素化的羊抗兔IgG为二抗。取骨髓沉渣涂片,按SABC免疫组化试剂盒说明书处理。在光镜下观察结果,胞膜为棕黄色者为阳性细胞,

7、在光镜(×400)下随机选取5个视野,计数阳性细胞数占白细胞总数的比例。1.2.4肺组织EOS计数及CCR3、CD34表达的检测无菌操作下切取部分肺组织,40g/L多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,分别进行HE染色、CCR3、CD34免疫组化染色(严格按武汉Boster公司SABC试剂盒说明书操作)。肺组织切片HE染色后,每张切片计数200个细胞,计算其中EOS百分比。免疫组化计数方法:光镜下观察胞膜着棕黄色为阳性细胞。每例选择1张染色较好的切片,显微镜下随机选取5个高倍视野(×400),计数,取每视野的均数。1.