哮喘豚鼠肺泡巨噬细胞中SH2Bβ的表达及NGFTrkA对其调控机制

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1、·英文缩略语·10中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所里交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：堑函日期：翮．丘≥中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工

2、作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：季葫·中文论著摘要·哮喘豚鼠肺泡巨噬细胞中SH2-B13的表达及NGF／TrkA对其调控机制目的支气管哮喘是一种复杂的疾病，气道炎症反应和气道高反应性是哮喘的重要病理生理学特点。而气道炎症和高反应性是通过

3、免疫细胞和神经细胞的双向信号调节完成的，故在哮喘的研究中寻找免疫细胞与神经细胞之间的双向信号分子成为焦点。研究表明神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)是这一双向信号分子。而NGF发挥的多种生物学功能通常是通过与其高亲和力受体．酪氨酸激活酶受体A(trosinekinasereceptorA。TrkA)结合后来来完成的。SH2．B13是位于细胞膜上的一种蛋白，研究发现它是TrkA的结合蛋白，NGF可以兴奋SH2．BB经SH2．BB的SH2．B区与TrkA相联系，使SH2．B13发生酪氨酸磷酸化，再作用于AKT／PKB，促使AKT／PKB进

4、一步激活。但SH2．B13是否参与了哮喘的发病以及是否也是通过此传导途径起作用目前尚不清楚。肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophages，AMs)是联系免疫系统和神经系统的纽带。故以AMs为研究对象，探讨SH2．B13在Aids的表达以及是否通过NGF-TrkA-SH2．BB传导途径在哮喘中发挥作用，从而从细胞内生物信号传导角度阐明AMs在哮喘发病的分子生物学机制的作用，并为探讨哮，喘治疗新的靶点及更有针对性地采取防治措施提供重要的科学依据。I、哮喘豚鼠模型的制备材料与方法清洁级健康雄性白化豚鼠60只，体重250．3009，随机分为5组：(1)PBS

5、对照组(n=10)；(2)哮喘组(n=12)；(3)anti-NGF抗体组(n=14)；(4)anti．TrkA抗体组(n_14)；(5)布地奈德混悬液组(n=10)。实验第l天，(2)(3)(4)(5)组腹腔注射10％卵蛋白(ovalbumin，OVA)(含等量氢氧化铝凝胶)lml，对照组(1)腹腔注射PBSlml．第15天(2)(3)(4)(5)组进行超声雾化吸入0．5％OVA，每天一次，每次2-"5分钟左右至喘息发作，共5天，但(3)(4)(5)组在吸入0．5％OVA前3小时分别给与anti．NGF抗体、anti．TrkA抗体、布地奈德混悬液干预，每天

6、1次，共5天。对照组用PBS超声雾化，时问同哮喘组。2、气道反应性测定最后一次吸入OVA24小时内检测气道反应性，戊巴比妥腹腔注射麻醉，将对照组、哮喘组、布地奈德组豚鼠应用AniRes2005动物肺功能分析系统(北京贝兰博科技有限公司)检测气道阻力(包括吸气阻力和呼气阻力)。3、血管灌注，豚鼠处死，留取血清及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALA)和肺组织BALF细胞成分计数。ELISA法检测BALF上清中IL．4及IL．113水平。各组肺组织HE病理检测。4、AMs的纯化BALF离心后沉淀细胞加入10％FCS．16

7、40，放入培养瓶和事先放有盖玻片的24孔板内放入5％C02孵箱内贴壁培养2小时。将24孔板内的盖玻片取出冲洗干净做免疫荧光染色和免疫细胞化学检测，培养瓶中贴壁的AMs用0．02％EDTA-Na2消化下后收集，--70℃冻存待测免疫印迹。5、HE染色观察肺组织病理学变化将各组豚鼠肺组织用石蜡包埋、切片(5岬)后，进行HE染色，光镜下观察并照相。6、荧光染色观察SH2．Bp在对照组和哮喘组豚鼠AMs的表达将有AMs的盖玻片用4％多聚甲醛固定30分钟，PBS洗片后做SH2．B13荧光染色(T砌TC．SH2．BB)。荧光显微镜观察并照相。27、免疫细胞化学染色检测A

8、!VIs中SH2．Bp、TrkA的表达取对照组、哮喘