严重烧伤大鼠离体肺泡巨噬细胞cd14表达调控的实验研究

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1、严重烧伤大鼠离体肺泡巨噬细胞CD14表达调控的实验研究作者：李友良郇京宁陈玉林夏照帆王光毅郭云贾氢【摘要】　　目的探讨严重烧伤对体外培养大鼠肺泡巨噬细胞(AM)CD14膜蛋白(CD14)和mRNA基因表达变化的影响，以及抗CD14抗体对AM产生肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素6(IL6)的调控作用。方法(1)成年SD大鼠84只，分为烧伤组和内毒素(LPS)组(每组42只)，每组均分为1，2，4，6，8，10和12h共7个时相点，并设对应的对照组(各6只大鼠)。大鼠烧伤和LPS注射后检测外周

2、血LPS浓度。(2)成年SD大鼠168只，分为烧伤血清组、血清抗体组、LPS组、LPS抗体组(每组42只)，每组均分为1，2，4，6，8，10和12h共7个时相点，并设对应的对照组(各6只大鼠);各组大鼠行全肺在体支气管肺泡灌洗分离AM，并按时相点分别进行体外培养。以上4组分别加入烧伤血清、烧伤血清+抗体、LPS、LPS+抗体，在以上相同时相点终止培养，RTPCR、免疫组织化学及ELISA方法分别检测4组AM在各时相点CD14mRNA表达、蛋白表达及分泌TNFα和IL6的变化。结果(1)烧伤组与

3、烧伤对照组、LPS组与LPS对照组比较发现，烧伤及LPS注射后大鼠各时相点外周血LPS浓度均明显高于对照组。(2)烧伤血清组、LPS组与对应的对照组比较发现，烧伤血清组、LPS组大鼠AM各时相点CD14mRNA表达、蛋白表达均明显增高，AM培养上清中TNFα和IL6浓度亦相应显著增高(P<0.01)。以烧伤血清与AM培养110h后，烧伤血清组培养上清中TNFα和IL6浓度即显著增加。与烧伤血清组比较，血清抗体组AM在各时相点CD14mRNA表达、蛋白表达显著降低(P<0.01)，T

4、NFα和IL6浓度亦显著降低(P<0.01)。与LPS组比较，LPS抗体组AM在各时相点CD14mRNA表达、蛋白表达显著降低(P<0.01)，TNFα和IL6浓度亦显著降低(P<0.01)。结论严重烧伤后外周血LPS浓度增加，离体AMCD14mRNA表达和蛋白表达均显著增加，使LPS对免疫系统的激活作用显著增大;AM分泌TNFα和IL6明显增加，而抗CD14抗体可以明显拮抗AM合成和分泌炎性介质。提示严重烧伤后通过调节CD14的作用而减少炎性介质的合成和分泌是可行的。【

5、关键词】巨噬细胞肺泡白细胞介素6肿瘤坏死因子α抗原CD14烧伤大鼠Wistar疾病模型动物　　严重烧伤后大量肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素6(IL6)等前炎性细胞因子释放，导致全身炎症反应综合征(SIRS)的发生。单核巨噬细胞在此过程中起关键作用，它不仅是大量细胞因子的来源，也可能是后续炎症反应放大的启动因素，但其中的机制尚有较多不明之处。本实验通过观察内毒素(LPS)受体CD14在烧伤大鼠肺泡巨噬细胞(AM)产生TNFα和IL6中的作用及CD14抗体的阻断作用，探讨LPS信号传导

6、通路对SIRS产生的影响，以及烧伤后抑制细胞因子过量分泌的可能途径。10　　1材料和方法　　1.1烧伤模型及烧伤血清制备成年SD大鼠84只，体质量200g左右[第二军医大学训练部实验动物中心提供，动物合格证号:SYXK(军)2000012]，随机分为烧伤组和对照组(假烫组)，再于1，2，4，6，8,10和12h各时相点分为7组，每组大鼠6只。气管穿刺注入植物血凝素0.4mL(100mg/mL)，3d后进行实验。烧伤组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，背部去毛，恒温水烫仪(第二军医大学烧伤

7、科实验室研制)100℃烫10s，制成20%Ⅲ度烧伤模型(经病理证实);对照组大鼠以37℃水模拟烫伤过程。分别于伤后1,2,4,6,8,10,12h处死动物，分离AM和外周血血清，每只动物取血清0.5mL进行LPS检测，其余血清置于-70℃冰箱备用。　　1.2LPS检测取上述分离血清，依合成基质偶氮显色法试剂盒(批号960702，上海医学化验所)主要步骤进行，反应终产物在波长545nm处比色测吸光度，依所测吸光度(D)值在标准曲线上换算成LPS含量，每次检测标本分别绘制标准曲线。　　1.3AM的提取培养

8、大鼠处死后立即开胸，用PBS缓冲液行全肺在体支气管肺泡灌洗(BAL)，灌洗液以860r/min4℃离心10min，弃上清，加含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为10610mL-1，接种于24孔板，每孔2mL，置37℃、体积分数为0.05的CO2温箱孵育1h，PBS洗去未贴壁细胞，贴壁细胞主要为AM。取部分细胞样品做细胞过氧化物酶纯度和台盼蓝拒染活力鉴定，纯度和活力均>95%。将上述部分细胞用于mRNA含量测定，部分进行CD14蛋