维生素e琥珀酸酯下调mdr1-pgp表达逆转k562-adm耐药细胞的凋亡抑制

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1、维生素E琥珀酸酯下调mdr1/Pgp表达逆转K562/ADM耐药细胞的凋亡抑制：郭璐，魏虎来，张亚莉，刘建民【摘要】　　目的研究维生素E琥珀酸酯（VitaminEsuccinate,VES）诱导多药耐药K562/ADM细胞凋亡的分子机制。方法采用四氮唑蓝比色法（MTT）检测K562/ADM增殖活性；细胞形态学和AnnexinV/PI双标记法检测细胞凋亡；RTPCR检测mdr1基因和Caspase3基因mRNA的表达；流式细胞法（FCM）测定Pgp蛋白表达水平和Caspase3活性。结果VES显著抑制K562/ADM细胞的增殖；经VES处理后细胞形态上出现典型的凋

2、亡改变；AnnexinⅤ/PI双染检测凋亡细胞明显增加；mdr1mRNA表达和P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）合成明显降低，Caspase3mRNA表达和Caspase3活性显著增强；VES增加K562/ADM细胞对ADM的敏感性。结论VES诱导mdr1/Pgp高表达的K562/ADM耐药细胞凋亡，其主要机制为下调mdr1/Pgp表达而逆转Pgp介导的细胞凋亡抑制和耐药性。【关键词】维生素E琥珀酸酯　多药耐药　凋亡抑制　P糖蛋白；Caspase3；白血病KeyinEsuccinate;Multidrugresistance;Apoptos

3、isresistance;Pglycoprotein;Caspase3;Leukemia　　维生素E琥珀酸酯（VitaminEsuccinate,VES）是α生育酚的6位羟基与琥珀酸酯化而形成的衍生物。研究证实，VES可选择性地杀伤人白血病、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞，而对正常细胞无抑制效应[13]。有关VES对耐药白血病（肿瘤）细胞作用的研究少见，我们曾研究证实VES可抑制白血病K562/ADM耐药细胞增殖并诱导其凋亡[4]。本文以白血病多药耐药K562/ADM细胞为模型，观察VES诱导其凋亡过程中耐药基因mdr1及其编码产物P糖蛋白（Pglycopro

4、tein，Pgp）表达的变化，探讨VES诱导耐药细胞凋亡的分子机制。1材料和方法1.1试剂维生素E琥珀酸酯（VitaminEsuccinate,VES）为美国Sigma公司产品，用无水乙醇配制成50mmol/L的储存液。RPMI1640为美国GibcoBRL公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。阿霉素（ADM）为日本明治制药公司产品。MTT、SDS、琼脂糖、RNase、溴化丙锭（EB）、碘化丙啶（PI）和二乙基焦碳酸（DEPC）均由美国Sigma公司出品。100bpDNALadderMarker由美国Promega公司出品。抗Pgp单抗（MRK16）为

5、KamiyaBiomedical公司产品，PE标记的羊抗鼠IgG2a为Caltag公司产品。TRIZOL试剂由美国Invitrogen公司生产。AMV一步法RTPCR试剂盒购自上海生物工程有限公司。mdrl、Caspase3和βactin基因引物由上海生物工程有限公司合成。FITC标记的DEVDFMK和AnnexinV试剂盒为Biovision公司产品。1.2细胞培养K562/ADM多药耐药白血病细胞由兰州大学医学实验中心保存，细胞在含有15%小牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mmol/LL谷氨酰胺的RPMI1640完全培养基中，置37℃

6、、5%CO2孵箱中培养，定期添加ADM（～5.0mg/L）以刺激mdr1/Pgp高表达。细胞在无ADM的条件下培养1周后用于实验。1.3细胞增殖活性K562/ADM细胞以2×108/L接种于96孔培养板（Costar）中，分别加入10～60μmol/LVES，对照组加入终浓度<0.2%（V/V）的无水乙醇。培养24～96h后MTT比色法[5]检测，并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（IC50）。1.4细胞形态学观察VES处理后的K562/ADM细胞，细胞离心涂片机（StatSpinCytofuge2型）离心涂片，1230）观察细胞超微结构。1.5AnnexinⅤ

7、/PI双标记检测凋亡细胞按试剂盒说明操作。收集K562/ADM细胞，PBS洗涤，重悬于BindingBuffer中，加入PI和FITC标记的AnnexinⅤ，室温避光染色5min，流式细胞仪（BeckmanCoulterEpicsXL）检测[6]。1.6RTPCR检测mdr1和Caspase3基因mRNA表达TRIZOL法提取细胞总RNA，以βactin为内参照，AMV一步法RTPCR检测mdr1和Caspase3基因mRNA表达情况。引物分别为：mdr1：上游5’CCCATCATTGCAATAGCAGG3’，