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时间:2018-07-07
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1、维生素E琥珀酸酯下调mdr1/Pgp表达逆转K562/ADM耐药细胞的凋亡抑制论文郭璐,魏虎来,张亚莉,刘建民【摘要】目的研究维生素E琥珀酸酯(VitaminEsuccinate,VES)诱导多药耐药K562/ADM细胞凋亡的分子机制。方法采用四氮唑蓝比色法(MTT)检测K562/ADM增殖活性;细胞形态学和AnnexinV/PI双标记法检测细胞凋亡;RTPCR检测mdr1基因和Caspase3基因mRNA的表达;流式细胞法(FCM)测定Pgp蛋白表达水平和Caspase3活性。结果VES显著抑制K562/ADM细胞的增殖;经VES处理后细胞形态上出现典型的凋
2、亡改变;AnnexinⅤ/PI双染检测凋亡细胞明显增加;mdr1mRNA表达和P糖蛋白(Pglycoprotein,Pgp)合成明显降低,Caspase3mRNA表达和Caspase3活性显著增强;VES增加K562/ADM细胞对ADM的敏感性。结论VES诱导mdr1/Pgp高表达的K562/ADM耐药细胞凋亡,其主要机制为下调mdr1/Pgp表达而逆转Pgp介导的细胞凋亡抑制和耐药性。【关键词】维生素E琥珀酸酯多药耐药凋亡抑制P糖蛋白;Caspase3;白血病KeyinEsuccinate;Multidrugresistance;Apoptosis
3、resistance;Pglycoprotein;Caspase3;Leukemia维生素E琥珀酸酯(VitaminEsuccinate,VES)是α生育酚的6位羟基与琥珀酸酯化而形成的衍生物。研究证实,VES可选择性地杀伤人白血病、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞.freeldr1及其编码产物P糖蛋白(Pglycoprotein,Pgp)表达的变化,探讨VES诱导耐药细胞凋亡的分子机制。1材料和方法1.1试剂维生素E琥珀酸酯(VitaminEsuccinate,VES)为美国Sigma公司产品,用无水乙醇配制成50mmol/L的储存液。RPMI1640为美国
4、GibcoBRL公司产品;新生牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。阿霉素(ADM)为日本明治制药公司产品。MTT、SDS、琼脂糖、RNase、溴化丙锭(EB)、碘化丙啶(PI)和二乙基焦碳酸(DEPC)均由美国Sigma公司出品。100bpDNALadderMarker由美国Promega公司出品。抗Pgp单抗(MRK16)为KamiyaBiomedical公司产品,PE标记的羊抗鼠IgG2a为Caltag公司产品。TRIZOL试剂由美国Invitrogen公司生产。AMV一步法RTPCR试剂盒购自上海生物工程有限公司。mdrl、Caspase3和βacti
5、n基因引物由上海生物工程有限公司合成。FITC标记的DEVDFMK和AnnexinV试剂盒为Biovision公司产品。1.2细胞培养K562/ADM多药耐药白血病细胞由兰州大学医学实验中心保存,细胞在含有15%小牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mmol/LL谷氨酰胺的RPMI1640完全培养基中,置37℃、5%CO2孵箱中培养,定期添加ADM(~5.0mg/L)以刺激mdr1/Pgp高表达。细胞在无ADM的条件下培养1周后用于实验。1.3细胞增殖活性K562/ADM细胞以2×108/L接种于96孔培养板(Costar)中,分别加入10~6
6、0μmol/LVES,对照组加入终浓度0.2%(V/V)的无水乙醇。培养24~96h后MTT比色法5检测,并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)。1.4细胞形态学观察VES处理后的K562/ADM细胞,细胞离心涂片机(StatSpinCytofuge2型)离心涂片,1230)观察细胞超微结构。1.5AnnexinⅤ/PI双标记检测凋亡细胞按试剂盒说明操作。收集K562/ADM细胞,PBS洗涤,重悬于BindingBuffer中,加入PI和FITC标记的AnnexinⅤ,室温避光染色5min,流式细胞仪(BeckmanCoulterEpicsXL)检测6。1.
7、6RTPCR检测mdr1和Caspase3基因mRNA表达TRIZOL法提取细胞总RNA,以βactin为内参照,AMV一步法RTPCR检测mdr1和Caspase3基因mRNA表达情况。引物分别为:mdr1:上游5’CCCATCATTGCAATAGCAGG3’,下游5’GTTCAAACTTCTGCTCCTGA3’,扩增产物167bp;Caspase3:上游5’CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG3’,下游5’GCATACTGTTTCAGCATGGCAC3’,扩增产物272bp;βactin:上游5’
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