mirna34b甲基化状态与非霍奇金淋巴瘤相关性研究

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1、MiRNA34b甲基化状态与非霍奇金淋巴瘤相关性研究材料与方法(Materials&Methods)1.材料1.1病例收集收集1990-2009年石河子大学第一附属医院病理科非霍奇金淋巴瘤石蜡组织70例,包括弥漫性大B淋巴瘤（DiffuseLargeB-cellLymphoma,DLBCL）40例、滤泡性淋巴瘤（FollicularLymphoma,FL）16例、结外边缘区B细胞淋巴瘤（mucosa-associatedlymphoidtissue,MALT）8例、T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-cellnon-Hodgkin，slymphoma,T-NHL)6例

2、和20例淋巴结反应性增生(reactivehyperplasia,RH)石蜡包埋组织标本及临床资料，根据WHO2001年提出的淋巴瘤分类对常规HE切片和免疫组化切片进行复诊和分型。90例入选样本资料见附录。病例组非霍奇金淋巴瘤标本70例，平均年龄（57.00±15.37）,高发年龄组为55～85岁；男女患病比例为2.89:1。对照组淋巴结反应性增生20例，平均年龄（54.45±14.54）岁，男女患病率为3:1。90例入选样本资料临床病理特点见表1-1。表1-190例样本资料的临床病理特点特征例数（例）百分比（％）性别男性6774.4女性2325.6年龄≤3

3、555.635～553538.955~855055.6组织学类型弥漫性大B细胞淋巴瘤4044.4滤泡性淋巴瘤1617.8结外边缘区B细胞淋巴瘤88.9T-NHL淋巴瘤66.7反应性增生2022.23MiRNA34b甲基化状态与非霍奇金淋巴瘤相关性研究1.主要试剂(1)二甲苯、无水乙醇、异丙醇、饱和酚、酚氯仿异戊醇（25：24：1）、氯仿异戊醇（24：1）、5×TBE、EDTA、硫代硫酸钠(2)dNTP（2.5mmol/L）（上海生物工程公司）(3)10×PCR缓冲液（含Mg2+）(4)ddH2O（无RNA酶）(5)TaqDNA聚合酶（上海生物工程公司）(6)

4、上样缓冲液(7)DNAMarker1(8)EZ-96DNA甲基化试剂盒（ZymoResearch,OrangeCounty,CA）(9)蛋白酶K（20.0mg/ml）（上海生物工程公司）蛋白酶K50.0mg双蒸水至2.5ml(10)LysisBuffer（细胞裂解液提DNA使用）1mol/LTris-HCL(PH=8.0)2.0ml1.mol/LEDTA(PH=8.0)4.0mlSDS2.0g双蒸水至100.0ml(11)2%琼脂糖凝胶琼脂糖2gTBE工作液100mlGOLDVIEW5.0u(12)MassCLEAVE试剂盒（Sequenom,SanDieg

5、o）1.虾碱性磷酸酶（Shrimpzlkalinephosphatase,SAP）（Sequenom）.2.去离子树脂（Sequenom）3.384-孔质谱芯片（Sequenom）1.3检测甲基化PCR引物由上海生物工程公司（Sangon）合成。引物设计参考Sequenom 公司2007年11月公布的Sequenom®StandardEpiPanel（http://www.sequenom.com/ SequenomStandardEpiPanel.pdf），使用EpiDesigner(http://www.epidesigner.com)设计PCR引物（图

6、4MiRNA34b甲基化状态与非霍奇金淋巴瘤相关性研究1-2）。引物序列详见（表1-3）。图1-2示在以MassCLEAVE为基础甲基化分析中的引物设计以及尾端结构（A）描述T7启动子末端包含一个8bp标记，具有在转录过程中降低失败的循环数的作用；（B）显示10个寡核苷酸标记的序列；（C）PCR成对引物组成通过反义链转录促使下一步G/A序列改变而进行甲基化分析。表1-3PCR甲基化引物序列引物名称引物序列MiRNA34b-16FaggaagagagGTTATATGGATGGAGGGGTTTTATMiRNA34b-16Rcagtaatacgactcactata

7、gggagaaggctACTACCATCAAAACAAAACACAACA1.主要仪器设备1.MassARRAYNanodispenser2.EpityperTMsoftwareV1.03.MassARRAY质谱仪（Bruker-sequenom）4.60℃烤箱和37-45℃恒温箱5MiRNA34b甲基化状态与非霍奇金淋巴瘤相关性研究1.PCR仪（BIO-RAD公司）2.-20℃冰箱3.DYY-Ⅱ垂直电泳仪（北京市六一仪器厂）4.UV2401PC型紫外线分光光度仪（SHIMADZU公司）5.低温高速离心机（江苏太仓医疗器械厂）6.AB204-E电子天平（Mon

8、oBloc公司）7.SSY-H水浴箱（常州国华电子有