rasfonin抗肿瘤活性评价及机制研究

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1、博士学位论文缩略词表ODOpticaldensity光密度值PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PDGFRPlatelet-derivedgrowthfactorreceptor血小板衍生生长因子受体PKBProteinKinaseB蛋白激酶BPIPropidineiodide碘化丙啶PI3KPhosphatidylinositol3-kinase磷脂酰肌醇3-激酶PSPhosphatidylserine磷脂酰丝氨酸P70S6KRibosomalproteinS6kinase,70kDa核糖体蛋白S6激酶RafRapidly

2、AcceleratedFibrosarcoma加速纤维肉瘤RCE1Rasconvertingenzyme1Ras转化酶1ROSReactiveoxygenspecies活性氧基团SDSSodiumdodecylsulphate十二烷基硫酸钠TBSTTris-bufferedsalineTris缓冲生理盐水TrisTrihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷VEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子第2页博士学位论文中文摘要Rasfonin抗肿瘤活性评价及机制研究中文摘要学位申请人姓

3、名：李玲学号：102061申请学位门类和级别：医学博士指导教师：张永祥研究员周文霞研究员专业名称：药理学年级：2010级培养单位：军事医学科学院毒物药物研究所随着肿瘤生物学的飞速发展，抗肿瘤药物的研发焦点已从传统的细胞毒类药物转向了靶向抗肿瘤药物。ras是一类重要的癌基因，与人类肿瘤相关的主要有三种：Harveyras（H-ras）、Kirstenras（K-ras）和Neuroblastomaras（N-ras）。其中，K-ras与人类肿瘤的关系最为密切。研究表明，90%的胰腺癌患者均存在K-ras基因突变。ras基因突变后Ras蛋白持续激活，升高胞

4、内Ras-GTP水平，并对抗GTP酶激活蛋白（GTPaseactivatingprotein，GAP）的负性调节，造成下游信号通路Raf-MEK-ERK的过度激活，从而导致细胞的过度增殖与肿瘤的发生。因此，针对Ras信号通路的肿瘤靶向治疗成为肿瘤靶向治疗学新的研究热点。Rasfonin是一种从真菌中分离获得的α-吡喃酮类化合物。初步研究发现，Rasfonin可选择性地抑制ras癌基因依赖小鼠B细胞系Ba/F3-V12细胞的存活，并可诱导细胞大量凋亡，而对ras基因非依赖的细胞系无明显影响，提示rasfonin可能具有抗ras基因突变肿瘤的作用。然而，由

5、于rasfonin不论是提取还是化学合成均非常复杂，得率极低，因此，一直无法对其进行深入的药理学评价，限制了其进一步研究。本研究所车永胜教授课题组最近从青藏高原海拔4千米以上的土壤样品中分离到一种使发酵获取rasfonin效率大大提高的真菌Doratomycessp.，目前使用该菌已分离获得数百毫克纯度＞98%的rasfonin，使得药理学研究成为可能。本课题对rasfonin的抗肿瘤活性进行了较为系统地评价并对其抗肿瘤机制进行了较为深入的探讨。第3页博士学位论文中文摘要一、Rasfonin体外抗肿瘤活性评价1.Rasfonin及其类似物体外对ras突

6、变及非突变肿瘤细胞的选择性抑制作用为明确rasfonin对ras突变的肿瘤细胞的选择性，本研究选择了多种组织来源的ras突变肿瘤细胞系（结肠癌SW620细胞、胰腺癌Panc-1细胞、膀胱癌T24细胞）作为研究对象，并用ras非突变的相应肿瘤细胞（结肠癌Caco2细胞、胰腺癌BxPC-3细胞、乳腺癌MCF-7细胞）作为对照，观察了rasfonin及其类似物（A305、A306、A307等10个天然产物）对各种细胞存活的影响。结果表明，rasfonin、A305和A306对ras突变的肿瘤细胞均有选择抑制作用，其中rasfonin抑制ras突变肿瘤细胞存活

7、的IC50为4.45-10.16μM，而在此浓度范围内对ras非突变的肿瘤细胞的存活无明显影响，提示rasfonin对ras突变的肿瘤细胞具有较高选择性。2.Rasfonin对ras突变及非突变胰腺癌细胞增殖的影响由于K-ras突变在胰腺癌中的比例为90%以上，我们选择了Panc-1（K-ras突变）和BxPC-3（野生型）两种胰腺癌细胞系，采用MTS法和xCELLigence实时细胞分析系统对细胞生长进行了观察。研究发现，rasfonin抑制Panc-1细胞增殖的起效浓度为5μM，而抑制BxPC-3细胞增殖的起效浓度为10μM。结果提示，rasfon

8、in对ras突变的胰腺癌细胞增殖有一定的选择性抑制作用。3.Rasfonin对ras突变肿瘤细