小檗碱抗肿瘤活性筛选及作用机制研究

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1、学校代码５９＾ＩＭＫ＾学号或巾请号２０１５２２２８３３０５ｍ／７密级鄞Ｗ土ｆ专业硕士学位论文小檗碱抗肿瘤活性筛选及作用机制研究作者姓名：张创导师姓名：张雁冰教授专业学位名称：药学颂士培养院系：药学院２０１８完成时间：年４月摘要摘要小檗碱具有一定的抗肿瘤活性，先利用基因芯片测定小檗碱的基因表达谱数据，然后与CMap数据库作对比，预测小檗碱抗肿瘤的作用机制，再利用CCK-8法确定研究小檗碱抗肿瘤作用机制时所使用的肿瘤细胞。方法：首先用小檗碱处理MCF-7人乳腺癌细胞抽提出的RNA做基因芯片测定了小檗碱的基因表达谱数

2、据，其中芯片类型为AffymetrixHumanGenomeU133A2.0。通过小檗碱的基因表达谱数据与CMap数据库的对比，预测小檗碱可作为一种Hsp90抑制剂，也可作为一种HDAC抑制剂，或者可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路促进肿瘤细胞的凋亡。然后通过CCK-8法测定小檗碱对几种实验室常用的肿瘤细胞的抑制活性，其中对SW480人结肠癌细胞的抑制活性最好，因此后续的验证实验选择SW480细胞。然后通过流式细胞仪检测了小檗碱对SW480细胞的凋亡、线粒体膜电位以及周期的影响。又通过Cellularthermalshift检测在SW480细胞中，小檗碱是否与

3、Hsp90蛋白结合，通过Westernblot检测小檗碱是否影响Hsp90客户蛋白的表达，部分在结肠癌中高表达的HDAC的几个亚型以及PI3K/AKT/mTOR通路各蛋白的表达。最后通过CCK-8法及协同指数的计算分析了小檗碱和17-AAG（一种Hsp90抑制剂）或SAHA（一种选择性HDAC抑制剂）在SW480细胞中联合使用或者三者联合使用是否具有协同作用。结果：在检测的几种实验室常用的肿瘤细胞中，小檗碱对SW480人结肠癌细胞的抗肿瘤活性最好，其IC50为3.436±0.193µM。小檗碱可以促进SW480细胞通过线粒体凋亡途径发生凋亡，另外，在SW480细胞中

4、，小檗碱可以抑制PI3K/AKT/mTOR通路，并因此促进SW480细胞发生细胞自噬，阻滞SW480细胞的细胞周期在G1期。小檗碱与17-AAG或SAHA在SW480细胞中联合使用，均具有一定的协同作用。三者联合使用，也有一定的协同作用，并且协同作用更明显。另外由于在之前的一些报道中提到在一些肿瘤细胞中，Notch1通路的过表达可以负调控PTEN蛋白进而活化PI3K/AKT/mTOR通路，因此，我们还研究了小檗碱是否能够影响SW480细胞中的Notch1通路以及PTEN蛋白的表达。I摘要方法：我们利用Westernblot检测了经小檗碱处理后的SW480细胞中Not

5、ch1通路上各蛋白以及PTEN蛋白的表达。结果：小檗碱在SW480细胞中可以抑制Notch1通路上Jagged1，Notch1，NICD，Hes-1各蛋白的表达，即可以抑制Notch1通路的活性，因此推测小檗碱可能通过抑制Notch1通路的活性上调PTEN蛋白的表达从而抑制PI3K/AKT/mTOR通路促进SW480细胞的凋亡。结论：1.小檗碱在SW480细胞中可以抑制PI3K/AKT/mTOR通路，并因此通过线粒体凋亡途径促进SW480细胞的凋亡，还可以促进SW480细胞发生细胞自噬，阻滞SW480细胞周期在G1期。2.在SW480细胞中，小檗碱与Hsp90抑制剂

6、或HDAC抑制剂联合使用均具有协同作用，三者联合使用也具有协同作用，且协同作用的效果更明显。3.小檗碱在SW480细胞中可以抑制Notch1通路，并可能因此上调PTEN蛋白的表达抑制PI3K/AKT/mTOR通路。关键词：小檗碱CMapPI3K/AKT/mTOR通路Notch1通路IIAbstractAbstractThemechanismthatberberinepromotestheapoptosisofcoloncancercellswasfoundbycomparingwithCMap.Berberinehascertainanti-tumoractivit

7、y.BycomparingthegeneexpressionprofiledataofberberineandCMapdatabase,themechanismofberberineagainsttumorwaspredicted.ThenCCK-8wasusedtodeterminethetumorcellsusedtovalidatetheanti-tumormechanismofberberine.Methods:First,theRNAofMCF-7Humanbreastcancercellswastreatedwithberberinetomaketh