牛耳枫生物碱体外抗肿瘤活性成分筛选及作用机制研究

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1、密级。学校代码。1OO75分类号。学号。2OO91387医学硕士学位论文牛耳枫生物碱体外抗肿瘤活性成分筛选及作用机制研究学位申请人：王永丽揩导教师：曹志然教授学位类别：医学硕士学科专业：药理学授子单位：河北大学答辩日期：二O一二年五月U.D.C.：CODE：10075C1assifiedlndex：NO：20091387AdissertatiOnfOrtheDegreeOfM.medicinesSt1d1Onanti-canceractivit1andmechanismsOfchemica1cOnstit1entsfrOmDaPhniPh1111mca11cin1mCandi

2、date：WangYOng1iS1PervisOr：PrOf.ZhiranCaOAcademicDegreeAPP1iedfOr：MasterOfmdicineSPecia1t1：PharmacO1Og1Universit1：HebeiUniversit1DateOfOra1ExaminatiOn：Ma1，2012摘要摘要目的：对从牛耳枫中提取的多种生物碱进行体外抗肿瘤活性筛选，以研究其是否具有抑制肿瘤增殖作用，井对其抗肿瘤活性的有效成分做进一步的药理研究，从而探明其抗肿瘤作用机制及对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，为从该类植物中开发新型抗肿瘤药物提供理论实验依据方洁。1采用MTT

3、法检测牛耳枫生物碱对HeLa（人宫颈癌细胞株）A-549（人肺腺癌细胞株）MCF-7（人乳腺癌细胞株）HePG-2（人肝癌细胞株）和U-251（人神经胶质瘤细胞株）等5种肿瘤细胞株的体外抗肿瘤活性。采用6.25，12.5，25，5O，1OOug／mL的样品终浓度，研究牛耳枫生物碱作用于细胞2448及72h后，对不同肿瘤细胞系的增殖抑制作用井计算半数抑制浓度（1C5O），以筛选抗肿瘤活性较强的成分及敏感肿瘤细胞株。2采用瑞-姬染色光学显微镜观察FDA-P1双染荧光显微镜观察DNA琼脂糖凝胶电泳AnnexinV-F1TC／P1双染流式细胞仪检测及蛋白酶学分析等手段，在细胞分于水平

4、初步研究抗肿瘤活性较好的化学成分2-hydroxyyunnandaPhnineD对敏感瘤株HePG-2细胞的抗肿瘤作用机制，为进一步探讨其生物学活性奠定基础3采用MTT法检测2-hydroxyyunnandaPhnineD对小鼠静止及丝裂原激活的脾淋巴细胞增殖的影响，探讨2-hydroxyyunnandaPhnineD对机体免疫毒理作用结果。1牛耳枫生物碱抗肿瘤活性的初步筛选16种牛耳枫生物碱抗肿瘤活性筛选结果显示，2-hydroxyyunnandaPhnineD在体外具有较强的抗肿瘤活性，其对HeLaA-549MCF-7HePG-2和U-251等5种肿瘤细胞株均有一定的抑制

5、作用，其中对HePG-2细胞的抑制增殖作用最强，其24，48和72h的1C5O值分别为（5.3±O.1），（1.3±O.O）和（O.13±O.1）ug／mL，且具有量效（F＝232.39，P＜O.O5）和时效（F＝65.59，P＜O.O5）关系2作用机制的研究（1）瑞姬氏染色形态学观察1摘要倒置显微镜下观察到正常对照组的细胞膜完整，胞浆呈蓝色，胞质均匀，细胞核完整，染成紫红色，核仁明显2-hydroxyyunnandaPhnineD1Oug／mL处理HePG-2细胞48h后，细胞体积增大，胞质内细胞核周围出现大量空泡，且密度降低，但细胞膜及细胞核保持完整2-hydroxyyu

6、nnandaPhnineD3Oug／mL处理48h后，细胞膜完整性被破坏，胞浆内有空泡形成，细胞核破碎，且密度降低。1OOug／mL组处理后细胞破坏严重，细胞形态消失。（2）FDA-P1双染荧光显微镜观察正常对照组中细胞绝大部分发绿色荧光为有活力细胞，个别细胞发红色荧光，可能为自然死亡细胞。1O3Oug／mL2-hydroxyyunnandaPhnineD组中发红色荧光的细胞有所增加,说明细胞坏死或晚期凋亡增多，sTs组中以发红色荧光细胞为主，细胞死亡明显，表明2-hydroxyyunnandaPhnineD可使细胞死亡（3）琼脂糖凝胶电泳检测结果显示。2-hydroxyyu

7、nnandaPhnineD1O，3O和1OOug／mL处理HePG-2细胞48h后，均未见特征性的DNA梯状条带。（4）AnnexinV-F1TC／P1双染流式细胞仪检测凋亡及细胞周期检测HePG-2细胞分别经2-hydroxyyunnandaPhnineD处理244872h后，早期细胞凋亡率与正常对照组无明显变化（P＞0.05），晚期凋亡率和坏死率明显增加（P＜0.05），有统计学意义2-hydroxyyunnandaPhnineD1O3O和1OOug／mL处理48h后，HePG-2细胞晚期凋亡率分别