内皮祖细胞在股骨头坏死发病机制及治疗中的作用研究

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1、华中科技大学博士学位论文材料和方法1．实验材料与入选对象1.1主要设备及器材（1）全自动生化分析仪美国OLYMPUS公司AU2700（2）SysmexXT-1800i全自动血细胞分日本希斯美康公司析仪及其配套试剂（3）激光共聚焦显微镜FV-500日本奥林巴斯公司（4）HIRAYAMA高压灭菌锅HVE-50日本HIRAYAMA公司（5）涡漩混匀器中外合资深圳天南海北有限公司（6）电子分析天平瑞士MettlerToledo公司（7）Sigma3K30低温高速离心机德国SIGMA公司（8）S2-93自动双重纯水蒸馏机上海亚荣生化

2、仪器厂（9）流式细胞分析仪美国BectonDickinson公司（10）倒置相差光学显微镜德国Wilovert公司（11）冰箱BCD-190三星中国有限公司（12）二氧化碳培养箱美国ThermoScientificForma公司（13）超净工作台上海博讯医疗设备厂（14）80-2型水浴恒温箱上海手术器械厂（15）GZX-9146MBE电热恒温鼓风干上海shellgene公司燥箱（16）培养板美国Corning公司（17）细胞培养瓶美国Corning公司（18）注射器美国BectonDickinson公司（19）EDTA-K

3、2抗凝血管美国BectonDickinson公司（20）HIRAYAMA高压灭菌锅HVE-50日本HIRAYAMA公司5华中科技大学博士学位论文1.1实验试剂（1）DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白美国Vector公司（2）人纤维连接蛋白美国Chemicon公司（3）血管内皮生长因子英国Peprotech公司（4）碱性成纤维细胞生长因子英国Peprotech公司（5）胎牛血清美国GIBCO公司（6）FITC标记抗CD45抗体美国BectonDickinson公司（7）PerCP标记抗CD34抗体美国BectonDickinso

4、n公司（8）PE标记抗VEGFR2抗体美国R&D公司（9）同型IgG1-FITC，R-PE美国BectonDickinson公司（10）FITC标记荆豆凝集素I美国Sigma公司（11）人淋巴细胞分离液天津灏洋生物有限公司（13）4',6二脒基-2-苯吲哚盐酸（DAPI）美国Sigma公司（14）细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒上海碧云天生物技术有限公司（15）培养液：M199培养基（美国GIBCO公司），含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸，0.2%碳酸氢钠及常规的双抗（100u/ml青霉素及100u/ml链霉素），pH值调为7.

5、2~7.4，用塞氏滤器经0.22μm双层滤膜正压过滤除菌，分装后于-20℃保存备用。用时加入胎牛血清并使其终浓度为10%。（16）红细胞裂解液：碳酸氢钠（10mmol/L）84mg，EDTA-Na2(0.1mmol/L)3.72mg，NH4Cl802.3mg（150mmol/L）溶入90ml双蒸水中，以HCl调节PH至7.2，再加入三蒸水定容至100ml，塞氏滤器双层0.22μm滤膜正压滤过除菌，分装后置于4℃冰箱保存备用。（17）PBS：Sigma公司。袋装PBS干粉溶于1L四蒸水中，用塞氏滤器经0.22μm双层滤膜正压

6、过滤除菌，分装后于常温保存备用。（18）0.25%胰蛋白酶消化液：称取胰酶0.25g，加入100mlPBS中，搅拌4h冰浴中，调PH7.4，过滤、分装备用。（19）4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入800～900ml0.1mol/L6华中科技大学博士学位论文磷酸缓冲液，加热至60℃左右，持续磁力搅拌使粉末完全溶解，通常需滴加少许NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的磷酸缓冲液于1000ml，充分混匀。1.1入选对象本研究取得同济医学院医学伦理委员会批准以及所有参与者的知情同意书。于2007年

7、6月-2008年12月，选择54例于我院就诊的非创伤性的ANFH患者（32例男性，22例女性，24岁-65岁之间，平均年龄44.8岁），随机选择于我院健康体检的30例年龄匹配的健康人群（17例男性，13例女性，28岁-63岁之间，平均年龄46.7岁）。排除心血管疾病或癌症及视网膜病变等引起血管新生的患者。在生理周期的女性受试者也排除在外。所有受试者均采用统一标准进行评估，包括体格检查，实验室检测，临床诊断，以及疾病诊疗病史的调查。因此，有明显髋关节直接损伤或类似的外伤史的患者均排除在外。ANFH由X-线片或MRI进行诊断（

8、Steinberg分期Ⅰ－Ⅳ期）。按照传统的致病诱因，ANFH患者分为激素诱发组、酒精诱发组和自发组。（表1-1）表1-1入选对象的一般临床资料（±s）一般资料HC(n=30)ANFH(n=54)P值年龄（岁）46.7±6.544.8±7.10.163男性病例数(%)17(56.7)32(59.3)0.