内皮祖细胞移植对大鼠短暂性大脑中动脉栓塞治疗作用及机制的初步研究

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1、第三军医大学硕士学位论文内皮祖细胞移植对大鼠短暂性大脑中动脉栓塞治疗作用及机制的初步研究姓名：廖少华申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：陈康宁201205一．第三军医大学硕士学位论文—————————————————————————————————————————————————————一。一一_内皮祖细胞移植对大鼠短暂性大脑中动脉栓塞治疗作用及机制的初步研究摘要背景在缺血性脑血管病的治疗研究中，神经保护理论在基础研究和动物实验中都取得了较好的效果，但临床试验无明显疗效。溶栓治疗可有效恢复局部脑血流供应、挽救缺血半暗带组织，促进神经功能恢复，但由于时间窗过短侄4．5h

2、)限制了临床广泛应用。因此，研究者的眼光从单纯神经或血管的保护扩展到了神经血管单元保护的策略。2003年，ABPN提出设立血管神经病学专业的申请并得到了批准[1]。此后，人们开始把保护神经血管单元的研究作为解决脑缺血治疗困境的重要策略之一。在有关神经血管单元保护策略的研究中，人们改变了以往过多关注神经元或血管保护的理念，开始把神经元、胶质细胞、微血管内皮细胞及基质之间的相互作用作为一个整体来看待。其中，EPCs作为研究这一策略的途径之一，也已成为了大家关注的热点。EPCs移植可以在修复血管内皮损伤、促进血管生成(angiogenesis)和血管发生(vasculogenes

3、is)方面发挥保护作用，这一结果已得到了动物实验的验证【2、3】。同时，也有学者通过总结前人的实验研究推测HJ，EPCs移植还可能通过旁分泌细胞因子(VEGF、BDNF、HGF等)发挥神经保护作用，而且这一作用是独立于血管生成和血管发生作用以外的。结合以上观点，我们推测，EPCs移植有可能对神经血管单元发挥保护作用，而这一保护作用的重要机制之一是通过EPCs旁分泌VEGF介导的。VEGF称为血管内皮生长因子，它通过与受体结合促进内皮细胞增殖和新生血管形成。进一步研究表明，在神经细胞的应激状态下(如缺氧、葡萄糖剥夺等)，VEGF有神经保护和神经营养作用[5】。这一作用可能是通

4、过抑制神经细胞凋亡、促进神经发生和血管发生等途径实现。已有的实验证实，体外培养的EPCs有分泌VEGF的作用[61。但是，EPCs在体研究，即通过EPCs移植能否对脑缺血损伤发挥神经保护作用?其作用机制是什么?目前对这些问题的研究尚未取得一致意见。为此，我们的实验从EPCs可以在体外分泌VEGF的研究基础入手，通过构建大鼠tMCAO模型，经颈内动脉移植EPCs，采用免疫组织化学方法观察EPCs移植后是否能在缺血局部脑组织定位并旁分泌VEGF，并采用免疫组织化学、分子生物学等技术，观6第三军医大学硕士学位论文察不同时相皮质神经元凋亡及VEGF、caspase．3表达水平变化，

5、探讨三者之间变化的关系，旨在初步阐明EPCs移植对大鼠tMCAO模型的治疗作用及其机制，为临床缺血性脑血管疾病的治疗提供新的方法及理论依据。目的观察EPCs经颈内动脉移植对tMCAO大鼠脑缺血损伤的保护作用，并初步探讨其机制。方法(1)分离、培养、鉴定大鼠骨髓来源EPCs；(2)建立大鼠tMCAO模型；(3)经颈内动脉移植EPCs到tMCAO大鼠，设立PBS经颈内动脉注射作为对照；(4)观察如下指标：①采用干细胞染色示踪技术，观察EPCs能否定位于缺血局部脑组织；②采用普通HE染色观察大鼠缺血部位病理变化；③分别于移植后的第1、3、5、7天采用TUNEL法观察皮质神经元凋亡

6、变化、免疫组化法检测VEGF、Caspase．3表达变化、WesternBlot检测缺血局部脑组织VEGF表达量的变化。结果1、分离的大鼠骨髓来源单核细胞，经过VEGF、bFGF的诱导分化，培养的细胞表现出典型的“血岛样”集落、“铺路石”样细胞形态，具有吞噬DiI．aG．LDL功能，CD34和vWF细胞免疫荧光染色阳性。提示分离培养的细胞为EPCs。2、EPCs吞噬DiI．ac．LDL染色后胞浆呈红色荧光，经颈内动脉移植到大鼠tMCAO模型，3天后冰冻切片观察缺血局部脑组织，可以在毛细血管壁见到大量红色荧光细胞，在正常脑组织少见红色荧光细胞。PBS对照组缺血局部脑组织毛细血

7、管壁未见红色荧光细胞。提示经内颈动脉注射，EPCs可以定位于缺血脑组织。3、颈内动脉移植EPCs对tMCAO大鼠皮质神经元凋亡的影响：通过T切qEL法，观察缺血部位神经元凋亡，发现PBS颈内动脉注射对照组阳性细胞第1、3、5天分别为(105．72+2．69)、(132．96+2．88)、(145．12+3．22)，随时间延长逐渐升高且与前一时相点相比有显著差异(P<0．05)：而EPCs移植组阳性细胞数分别为(91．84+3．21)、(82．084-2．77)、(54．68+3．12)，随时间延长逐渐降低且与前一时