银杏内酯b对内皮祖细胞的保护作用及机制研究

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1、温州医学院硕士学位论文银杏内酯B对内皮祖细胞的保护作用及机制研究姓名：钱鲁申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：唐疾飞；季亢挺2012-05-17温卅I医学院硕士学位论文银杏内酯B对内皮祖细胞的保护作用及机制研究中文摘要目的：观察银杏内酯B(GinkolideB，GB)对氧化低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，OX—LDL)损伤后内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)功能的影响，并探讨其可能的保护机制。方法：密度梯度离心法获取脐血

2、单个核细胞，以5x106／cm2密度接种细胞到事先包被纤维连接蛋白的培养皿，加入含20％胎牛血清的EBM一2培养液，培养三天后，以培养液洗去未贴壁细胞后得到贴壁细胞，继续原条件培养、扩增、分化。培养7d后，通过DiI标记乙酰化人低密度脂蛋白(DiI—ac—LDL)和FITC标记的荆豆凝集素I(FITC-UEA-Ilectin)双染实验及Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定内皮祖细胞。收集贴壁细胞并随机分为对照组，氧化低密度脂蛋白组(50ug·mL。1)及银杏内酯B干预组(氧化低密度脂蛋白50ug·mL_l加银杏内酯B

3、，浓度分为50，100和150ug·mL。1)，干预24h后分别采用CCK8比色法、黏附能力测定实验、改良Boyden小室法观察EPCs的增殖能力、黏附能力和迁移能力，并取各组细胞裂解液行实时荧光定量PCR检测NF-KBP65mRNA的表达量。结果：人脐血单个核细胞培养三天后，形成典型内皮祖细胞样集落，培养第7天贴壁细胞DiI—ac—LDL和FITC—UEA—Ilectin双染实验阳性，荧光显微镜下发红色及绿色荧光。Ⅷ因子相关抗原免疫组化阳性，胞浆呈棕黄色。氧化低密度脂蛋白损伤后，EPCs的增殖能力(0．7

4、00±0．046VS1．119±0．031，尺O．01)、黏附能力(16．3±3．2VS27．9±5．1，尺0．01)，迁移能力(19．8±3．4VS38．3±2．6，尺0．01)显著受损，细胞裂解液NF—KBP65mRNA表达量(4．083±0．218倍，P(O．05)显著增高；银杏内酯B干预24h后，显著改善了外周血EPCs的增殖能力(1．069±0．032，1．184±0．044，1．262±0．060VS0．700±0．046，尸均<0．01)、黏附能力(16．9±2．8，19．8±3．3，25．8

5、±3．4VS16．3±3．2，尸均<0．05)，迁移能力(30．0±2．1，32．8±3．8，36．5±2．1VS19．8±3．4，P均<0．05)，细胞保护作用随银杏内酯B的浓度升高而增强，且银杏内酯B各组NF—KBP65mRNA表达量随银杏内酯B浓度升高而显著减少(1．437±0．1lO，1．587±0．091，2．707±0．127倍，尸均<0．05)。结论：1．银杏内酯B对氧化低密度脂蛋白损伤后内皮祖细胞的功能有显著保护作用。2．银杏内酯B对内皮祖细胞的保护作用机制可能与抑制NF—KBP65mRNA

6、的表达有关。温州医学院硕士学位论文关键词：银杏内酯B；内皮祖细胞；氧化低密度脂蛋白；NF—KB；P65GinkolideBprotectsendothelialprogenitorcellsimpairedbyoxidizedlow-densitylipoproteinAbsractObjective：Inthisstudy，weexaminedtheprotectiveeffectsofGinkolideBonin-vitroendothelialprogenitorcells(EPCs)ofhealth

7、yvolunteersdetrimentedbyoxidizedlowdensitylipoprotein(ox-LDL)．Methods：HumancordbloodmononuclearcellswereisolatedusingaFicollgradient．ThecellswereresuspensedinEBM．2，whichcontainsfetalcalfserum(FCS，20％，w／v)，andanti—biotics，andseededintosix-wellculturedishesw

8、hichwerepre-comedwithfibronectinforculture．Afterculturingfor7d，cellsweredigestedintocellsuspensionby0．25％(w／v)trypsin．thecellswereidentifiedthrouthimmunocytochemistryandVIII-relatedantigenimmunohistochemistry