银杏内酯b对阿霉素心脏毒性的体内外保护作用及其相关机制的研究

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1、银杏内酯B对阿霉素心脏毒性的体内外保护作用及其相关机制的研究TheprotectiveeffectofBN52021indoxorubicininducedcarditoxicityanditsrelatedmechanisms作者姓名：杨桂林专业名称：外科学研究方向：心肌细胞损伤及保护指导教师：柳克祥教授学位类别：医学博士培养单位：吉林大学第二医院论文答辩日期：2015年5月30日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位蒋树林教授哈尔滨医科大学主席蒋树林教授哈尔滨医科大学李华教授大连医科大学委员田伟忱教授哈尔滨医科大学王辉山主任医师沈阳军区总医

2、院李淑梅教授吉林大学第二医院谷天祥教授中国医科大学第一医院崔满华教授吉林大学第二医院佟倜教授吉林大学第二医院张柏民教授吉林大学中日联谊医院柳克祥教授吉林大学第二医院中文摘要银杏内酯B对阿霉素心脏毒性的体内外保护作用及其相关机制的研究阿霉素是目前临床上常用的一种高效广谱的蒽环类抗肿瘤药物，其具有显著剂量-效应关系，但是阿霉素的使用会带来许多不良反应，其中最主要的就是心脏毒性，心脏毒性的存在使阿霉素的临床使用受到了限制。近年来有关阿霉素心脏毒性的研究已经取得了许多进展，但有关其导致心脏毒性的机制尚为完全阐明，另外，有关心脏毒性的治疗方面目前仍无较为有效的策略。银杏内酯B（BN52021）是

3、一种从银杏叶中提取的具有生物活性的成分，前面的研究发现其能够有效的拮抗血小板活化因子的活性，并且在多种疾病中发挥抗炎性保护效应。目前有关其在心毒性中的研究仍不常见。我们在这里推测其对心脏毒性具有保护作用。本文将通过建立小鼠急性心毒性模型和小鼠心肌细胞模型来验证BN52021对心脏毒性的保护机制并阐明相关的作用机制。目的：探索和建立一种成功率高的小鼠心毒性模型，明确BN52021对小鼠心毒性的保护作用。通过体外小鼠心肌细胞心毒性的模型，明确BN52021对心毒性的保护作用的机制。方法：采用一次性腹腔注射DOX15mg/kg诱导急性心毒性模型，给予BN52021灌胃，每天1次，连续5天。7

4、天后观察小鼠体重和生存率的变化和心脏指数（心脏重量和体重的比值）的变化。制作小鼠心脏病理切片，观察小鼠心脏组织学变化。生化手段检测小鼠血清中乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）、肌酸激酶（creatinekinase，CK）。生化手段检测小鼠心肌组织中还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平。在细胞模型中通过不同浓度的阿霉素及BN52021处理小鼠心肌细胞H9c2，MTT法分析心肌细胞活性；TUNEL法检测心肌细胞凋亡；JC-1荧光标记法检测心肌细胞线粒体膜电位变化；DCFH-DA荧光标记法检测氧自由基；Western-blot检测凋亡蛋白（Caspas

5、e-3和Cyto-cytochromec）的表达水平；Fluo-3AM荧光探针检测心肌细胞胞内钙离子水平。Western-blot分析丝裂原蛋白激酶p38磷酸化情况，同时结合p38抑制SB203580和钙离子拮抗剂BATPA/AM处理分析这些通路活化对心肌细胞活性I和凋亡的影响。结果：相比于对照组小鼠，DOX组小鼠的体重明显减轻(p<0.01)。在心毒性诱导7天后，对照小鼠和DOX小鼠的在心脏指数上并无显著差异。然而，相比于对照组小鼠，DOX组小鼠的存活率显著降低(p<0.05)。DOX处理后7天，血清LDH检测结果显示，DOX组出现显著升高。血清CK水平也出现显著升高。小鼠心肌组织中

6、GSH和MDA水平也发生显著的改变现象。相比于DOX小鼠，BN52021治疗组小鼠的体重在心脏指数上有所增加，但并无显著差异。相比于DOX小鼠，BN52021治疗组小鼠的存活率有增高趋势，但无统计学意义。DOX处理后7天，血清LDH水平和血清CK水平检测结果显示，BN52021治疗组小鼠相比DOX组出现显著升高。另外，BN52021治疗组小鼠相比DOX组小鼠心肌组织中GSH水平增高和MDA水平降低。在采用BN52021预处理的心肌细胞中，细胞活性显著升高；细胞凋亡显著下降。JC-1法检测BN52021可显著减轻DOX导致的心肌细胞线粒体膜电位降低。DCFH-DA法检测结果显示BN520

7、21预处理可显著降低DOX引起的氧自由基水平升高。Western-blot的结果显示，BN52021可抑制DOX引起的心肌细胞Caspase-3、Cytochromec蛋白水平的升高。此外，Fluo-3AM法结果显示BN52021预处理还可显著抑制心肌细胞胞内钙离子水平升高的现象。Western-blot分析丝裂原蛋白激酶p38磷酸化显示BN52021预处理能够显著降低阿霉素引起的p38磷酸化水平升高。p38抑制剂SB203580和钙离子拮抗剂