阿霉素与苏尼替尼引起的心脏毒性及zmy对其保护作用的机制研究

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1、浙江大学博士学位论文阿霉素与苏尼替尼引起的心脏毒性及ZMY对其保护作用的机制研究姓名：赵玉勤申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：何俏军；杨波20120304浙江大学博士学位论文中文摘要阿霉素与苏尼替尼引起的心脏毒性及ZMY对其保护作用的机制研究浙江大学药学院博士研究生：浙江大学药学院博士研究生：导师：中文摘要药理学赵玉勤何俏军教授杨波教授一．研究目的：(1)探讨ZMY对阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞毒性的保护作用、ZMY对阿霉素引起的小鼠心脏毒性的保护作用，以及ZMY对阿霉素心脏毒性保护作用的分子机制。(2)探讨苏尼替尼

2、引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性作用，并探索ZMY对苏尼替尼引起的心肌细胞毒性的保护作用机制。二．研究方法：1．ZMY抗氧化活性及抗肿瘤活性作用研究：(1)DPPH法测定ZMY体外抗氧化活性研究；(2)MTT法测定ZMY与阿霉素合用对K562、NB4、U937白血病细胞的协同抑制作用；(3)建立U937裸小鼠移植瘤模型评价ZMY与阿霉素合用的体内抗肿瘤活性。2．ZMY对阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞毒性的保护作用及其机制研究包括：(1)MTT法测定阿霉素及合用ZMY对大鼠原代心肌细胞的抑制作用；(2)全自动生化分析仪测定阿霉素

3、及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞上清心肌酶谱的变化；(3)DCF法测定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞内活性氧(ROS)生成水平变VI浙江大学博士学位论文中文摘要化；(4)DAPI染色法检测阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞的凋亡情况；(5)JC．1法测定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞线粒体膜电位的变化；(6)Western-blot检测阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌细胞内凋亡蛋白的变化。3．ZMY对阿霉素引起的小鼠心脏毒性的保护作用研究：(1)建立ICR小鼠阿霉素心脏毒性模型，观察合用ZMY后小鼠体重的变化；

4、(2)观察合用ZMY后小鼠存活率的变化；(3)观察合用ZMY后小鼠血清心肌酶谱的变化。4．苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性作用及其机制研究包括：(1)MTT法测定苏尼替尼对H9c2细胞的抑制作用，计算Ic50值；(2)DAPI染色法检测苏尼替尼作用后H9c2细胞的凋亡情况；(3)AO染色法检测苏尼替尼作用后H9c2细胞内酸性白噬泡生成情况；(4)转染GFP．LC3质粒检测苏尼替尼作用后H9c2细胞内自噬泡生成情况。(5)Western．blot检测苏尼替尼作用后H9e2细胞内凋亡蛋白和自噬蛋白的变化；(6)siRNA

5、法沉默Beclinl基因的表达，抑制细胞自噬的水平，MTT法测定苏尼替尼作用后细胞存活率的变化；5．ZMY对苏尼替尼引起的大鼠H9c2心肌细胞毒性的保护作用及其机制研究包括：(1)MTT法测定苏尼替尼及合用ZMY对H9c2细胞的抑制作用的变化；(2)DCF法测定苏尼替尼及合用ZMY对H9c2细胞内活性氧生成水平变化；(4)AO染色法检测苏尼替尼及合用ZMY后H9c2细胞自噬情况的变化；(5)Western．blot检测苏尼替尼及合用ZMY后H9e2细胞内自噬相关蛋白的变化。三．研究结果：1．ZMY具有很强的抗氧化活性并能协

6、同增强阿霉素的体内外抗肿瘤活性：(1)ZMY具有良好的DPPH自由基清除作用，其自由基清除能力超过维生素C；(2)ZMY与阿霉素合用对三种白血病细胞表现出较强的体外协同抑制作用；(3)在U937裸小鼠移植瘤模型中，给药6天后，ADR2mg&g、ZMY500mg／l(g和合用组肿瘤抑瘤率(％)分别为14．5、18．0和57．1，T／C(％)值分别为69．4、73．5和41．3．结果证实ADR2mg&g和ZMY500mg／kg合用时可以显著抑制U937肿瘤的生长，具有很好的协同抗肿瘤效果。2．ZMY通过其抗氧化活性对阿霉素引起

7、的大鼠原代心肌细胞毒性的保护作用及VH浙江大学博士学位论文中文摘要机制：(1)ZMY对阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞毒性作用表现出较强保护作用，阿霉素作用24h后阿霉素2laM单用组和50pMZMY预处理组细胞抑制率分别为30．7％、14．5％；(2)心肌酶谱检测结果显示ZMY预处理组细胞比阿霉素单用组AST、LDH、CKMB值显著下降；(3)作用3h后阿霉素2¨M单用组ROS的生成为241．5％，50pMZMY预处理组细胞阿霉素作用3h后，ROS生成为80．O％，与阿霉素单用组相比ROS的水平显著降低；(4)DAPI染色发

8、现，合用ZMY后阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞的凋亡率随之降低；(5)合用ZMY后可以逆转阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞线粒体膜电位的降低；(6)Western-blot结果显示，ZMY可以通过抑制ERK，进而抑制P53激活来减少阿霉素引起的心肌细胞凋亡，同时实验结果表明ZMY还可以通过抑制JNK，P38激