家兔关节软骨细胞分离与培养

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1、家兔关节软骨细胞的分离与培养实验动物3周龄新西兰大白兔实验试剂胎牛血清,胰蛋白酶,II型胶原酶,台盼蓝,DMEM培养基,甲苯胺蓝染色剂主要试剂配制方法1.0.01mol/LPH7.2一7.4PBSNaCI8.0克KCI0.2克KH2PO30.2克Na2HPO3·12H2O2.08克精确称量上述药品并充分溶解于1000mL三蒸水中，用1mol/LHCI和1mol/LNaOH溶液调整pH值至7.2一7.4。2.DMEM培养液将DMEM干粉一包溶于1O00mL三蒸水中，按说明书加入NaHCO3，并加入双抗(终浓度为:青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)和维生素C(终浓度为:50mg/L)，

2、调节PH到7.0一7.2，超净工作台内过滤除菌。置一200C冰箱保存备用。如需含血清的培养基，于使用前加入足量56℃水浴灭活30分钟的胎牛血清(FCS)。.1.3主要实验仪器倒置显微镜,数码照相机,二氧化碳培养箱(2300型),超净工作台(SW-CJ一IF型),低温离心机(Megafuge1.oR型),电子天平(MAllo型)磁力搅拌器.2方法.2.1兔关节软骨细胞的培养与传代将一只健康的三周龄新西兰大白兔耳缘静脉空气栓塞处死，备皮，用碘酒消毒背部及四肢皮肤，在无菌操作下，在超净工作台内用手术刀削下双侧膝关节软骨，以不渗血为度。充分漂洗软骨小块。用眼科剪将软骨组织剪成约lmm3小的碎块，收集

3、置于离心管中，以PBS冲洗2次，向离心管加10一巧mLO.%胰酶。吹打成组织悬液，装入50mL玻璃培养瓶。放进二氧化碳培养消化1时。消化后将培养瓶静置桌上，待软骨组织沉淀后，吸出胰蛋白酶。将配好0.10kH型胶原酶10mL以滤器过滤入培养瓶，加入0.stnL胎牛血清。放进二化碳培养箱消化4一6小时。细胞从基质中释放于消化液中，经过滤除去未被消化的软骨碎片，将消化液置于离心管中100orpm、10min离心，弃上清液收集软骨细胞，加DMEM液，1000印m、10而n离心，冲洗2次，弃上清液，加入上述细胞培养液(含10%FBS的青霉素、链霉素的DMEM培养液)制成细胞悬液，滤网过滤，血球计数板计

4、数，并把细胞悬液稀释成2x105/c时的密度，接种于25c衬的培养瓶中，血球记数板计数。以台盼蓝染色法检查死亡细胞比例，死亡细胞比例约10%左右。把培养瓶置于二氧化碳培养箱中进行软骨细胞原代培养(温度37℃，饱和湿度，50k二氧化碳，950k空气)。每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况，72小时后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每两天更换培养液一次。待软骨细胞铺满瓶底后，进行传代培养。细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察软骨细胞聚集成片，待约80%的细胞汇合，即进行细胞传代。吸除培养液，PBS清洗后，加入0.25%的胰蛋白酶ZmL，室温下静置消化5一10分钟，倒置显微镜下观察细胞质回缩，细胞

5、重新变成圆形，细胞间隙增加，少量细胞开始浮游，此时迅速而轻柔地倾去胰蛋白酶溶液(不使瓶底细胞随胰蛋白溶液流失)。以PBS液轻洗一遍后加入新培养液。然后吹打细胞使其散开重新成细胞悬液，按前述方法分瓶培养。每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照，2一3天换液1次，待软骨细胞铺满瓶底后，再次进行传代。1.1.2.2软骨细胞的形态学观察以及组织化学染色鉴定1.1.2.2.1镜下观察软骨细胞并制作细胞爬片每日在倒置显微镜下观察软骨细胞形态、生长情况，照相。将传一代细胞按2x105/c时的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的6孔细胞培养板中，培养条件与原代培养相同，制作细胞爬片。1.1.2.2.2Gi

6、cmsa染色光镜观察细胞70%融合时取出细胞爬片，放在冰醋酸与甲醇之比为1:3的固定液中固定10分钟。晾干用Giemsa染液(将oiemsa原液用pH6.8的PBsl:10稀释)染色15分钟。晾干后用二甲苯、透明树脂封片。倒置显微镜下观察，并行细胞照相。1.1.2.2.3甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型细胞在盖玻片上长满后取出细胞爬片，PBS漂洗二次，70%乙醇固定20分钟以除去四价铵离子，以免影响染色，再用PBS漂洗二次后，吹干。加入甲苯胺蓝乙醇液(甲苯胺蓝0.29溶于30%乙醇IO0ml中配制而成)染色10分钟，用蒸馏水冲洗，倒置显微镜下观察并照相。因软骨细胞分泌的蛋白多糖能被甲苯胺蓝异染，呈红

7、色、紫红色，据此可鉴定软骨细胞的表型。讨论1.3.1软骨细胞的原代培养方法过去曾经广泛认为软骨细胞不具备分裂增殖的能力，故长久以来未能开展其体外培养研究。1967年，ManningandBonner用胰蛋白酶和胶原酶联合消化关节软骨，从坚韧的软骨基质中分离出来软骨细胞，获得数量充足且纯度比较高的软骨细胞接种于培养液中进行体外培养，并发现其具备分裂增殖的能力，从此开创了软骨细胞的体外培养技术，为研究OA提供了新