三步酶消化法高效分离兔原代关节软骨细胞及体外培养观察

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1、·522·中华外科杂志2005年4月第43卷第8期　ChinJSurg,April2005,Vol.43,No.8·基础研究·三步酶消化法高效分离兔原代关节 软骨细胞及体外培养观察周强　李起鸿　戴刚　石国华　　【摘要】　目的　观察设计的三步酶消化法分离原代关节软骨细胞的效果,并对体外培养不同代次细胞的生物学活性进行评价。方法　三步酶消化法设计为以培养液配制的1g/L胰蛋白酶及1g/LEDTA混合液、1g/L透明质酸酶和2g/LⅠ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞收获效率和存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长及胞外基质中Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的

2、变化。结果　(1)关节软骨经三步酶消化基质逐步解离和降解,细胞得以完全释放和分离,每克软骨的细胞收获量平均为5013×106个细胞,细胞存活率平均为9818%。(2)原代和第一代细胞附壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均呈阳性,原代细胞外基质有高的硫酸糖胺多糖含量为(92±10)μg/cm2;第三代后细胞逐渐变为梭形,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性,甲苯胺蓝异染反应明显减弱,第四代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量为(48±12)μg/cm2。结论　(1)三步酶消化法可使关节软骨基质完全消化降解,具有高细胞收获率、高细胞存活率和操作

3、简便等特点。(2)原代和第一代软骨细胞具有良好的生物学活性,而第三代以后的细胞生物学活性低下。【关键词】　关节软骨;　细胞分离;　软骨细胞;　组织工程Efficientisolationofchondrocytesfromrabbitarticularcartilagewiththree2stepenzymaticdigestion andobservationoftheirbiologicalcharacteristicsduringcultivationinvitro　　ZHOUQiang,LIQi2 hong,DAIGang,SHIGuo2hua1Depa

4、rtmentofOrthopaedics,SouthwestHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,ChinaCorrespondingauthor:ZHOUQiang,Email:zqtlh@mail1tmmu1com1cn【Abstract】　Objective　Toobservetheeffectofisolatingthechondrocytesfromarticularcartilage withthemethodofthree2stepenzymaticdigestion,

5、andthebiologicalcharacteristicsoftheisolated chondrocytesduringcultivationinvitroinordertoevaluatetheirbiologicalactivity1　Methods　Themethod ofthree2stepenzymaticdigestionwasdesignedthatthearticularcartilagewasdigestedonebyonewiththe1g/Ltrypsinand1g/LEDTA,1g/Lhyaluronidaseand2g/Lcoll

6、agenaseⅠintheculturemediumtoisolate chondrocytes1Theharvestingandviabilityrateoftheprimarychondrocytesweredetected1Duringthepassagecultivationinvitro,thechangesofthechondrocytesshapeandgrowthwereobserved,thechangesof thecollagentypeⅠandⅡandaggrecanintheextracellularmatrixwereinvestig

7、atedanddetected1　 Results　(1)Theextracellularmatixofarticularcartilagewascompletelydissolvedbythethree2step enzymaticdigestion,andthechondrocyteswerecompletelyisolatedfromthesolidmatrix1Thenumberofthe harvestedchondrocytesfromeverygramofwetcartilagewas5013×106onaverage,andtheirviabil

8、ityrate was9