腺相关病毒介导ctgf和timp1双基因联合体外转染人退变髓核细胞生物学效应观察

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1、中文摘要腺相关病毒介导的CTGF和TIMPl双基因联合体外转染人退变髓核细胞的生物学效应观察青岛大学医学院附属医院骨科研究生：魏见伟导师：胡有谷王德春摘要目的：构建人结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissueinhibitorofmetalloproteinases1，TIMPl)基因的腺相关病毒(adenoassociatedvirus，AAV)双表达重组质粒pSNAV2．CTGF-IRES—TIMPl，体外检测生物学活性后进行病毒包装，并评价口℃F和TIMPl基因逆

2、转人腰椎闯盘退变的可行性。方法：对构建的重组质粒pSNAVz．CTGF-IRES．TIMPl进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序，用脂质体介导重组质粒转染人胚肾293(HEK293)细胞，通过双重免疫荧光、Westernblot、MTI"法和ELISA等方法检测细胞因子CTGF和TIMPl蛋白的生物学活性。在此基础上进行病毒颗粒包装。rAAV2一CTGF-IRES—TIMPl感染体外分离培养并鉴定的人退变腰椎间盘髓核细胞，通过细胞形态学观察、氯胺T法、免疫组织化学法、35s整合法以及Antonopoulos法等检测CTGF和TIMPl对于人退交硬椎闯盘髓核细胞蛋

3、自多糖和II型胶原合成的影响。结果：成功构建了含有完全正确的CTGF和TIMPl基因序列的AAV重组质粒。包装出的具有生物学活性的rAAV2一CTGF-IRES．咖1病毒能够感染人退变腰椎间盘髓核细胞。CTGF和TIMPl联合可以促进髓核细胞蛋白多糖和II型胶原的合成。结论：腺相关病毒介导的CTGF和TIMPl可以通过促进髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成来延缓或逆转腰椎阈盘退变。关键词：CTGF；TIMPl；腺相关病毒；质粒构建；椎间盘注：本课题为国家自然科学基金资助项目(编号：30471750)英文摘要An／nv／trostudyofdegenerated

4、humanlumbarintervertebraldiscs：thebiologicaleffectsofCTGFandTIMPlounucleuspulposuscellsmediatedbyadenoassociatedvirusAbstract0bJ∞qive：Toconstructtherecombinantplasmidofadeno-associatedvii'uscontaininghumanconnectivetissuegrowthfactorandtissliehtMbitorofmetalloproteinases,pSNAV2-CT

5、GF-IRES-TIMPl，andtopackageintovirusparticlesafterdetectingthebiologicalactivity加咖．andthentoevaluatethereversionpossibilityofCTGFand∞m口1tohumanlumbarintervertebraldiscdegenerationbygenemethod．Methods：-11璩recombinantplasmidpSNAV2-CTGF-IRES-TIMPlwasidentifiedbyPCR,restrictionenzymesa

6、nalysisandsequencinganalysis,andthentransducedintoHEK293cellsbylipofectaminemediatedgenetransfermethod．Thedoublestainingimmunofiuorescence，Westernb10t，岍andELISAwereusedtodetectthebiologicalactivitiesofCTGFandT姗1proteins．andthentherecombinantplasmidwaspackagedtovirusparticles．rAAV2

7、-CrGF．ⅡLES-TIMPlwastransducedintohumannucleuspulposuscellsofdegeneratedlumbarintervertebraldiscs，whichhavebeenculturedandidentified／nv／tro，andthentodetectthechangesofproteoglycansandcollagentypeIIinnucleuspulposuscellsbycellmorphology,miaminemethod,immunohistochemistry,”Sincorpora

8、tionassayandAntonopoulosmethod．Re