慢病毒介导tgfβ3和timp1体外联合感染人髓核细胞的生物学效应

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1、分类号：R329.2密级：不保密UDC：610学校代码：11065硕士学位论文慢病毒介导TGFβ3和TIMP1体外联合感染人髓核细胞的生物学效应邱晨生指导教师陈伯华教授学科专业名称外科学（骨外科学）论文答辩日期2015年5月31日摘要目的：探讨慢病毒载体介导的转化生长因子β3（TGFβ3）、基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）联合感染对体外培养人退变椎间盘髓核细胞的影响，从而最终实现延缓甚至逆转椎间盘退变的目的。方法：单层培养人退变椎间盘髓核细胞，采用绿色荧光蛋白标记慢病毒（GV287-EGFP）评价其对髓核细胞的感染效率。应用构建的TGFβ3-P2

2、A-TIMP1慢病毒载体感染髓核细胞，在倒置纤维镜下观察细胞形态学变化，通过Real-timeqPCR技术检测感染后TGFβ3、TIMP1、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的mRNA表达量，通过Westernblot技术检测感染后Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量，最终评价应用携带TGFβ3-P2A-TIMP1的慢病毒载体体外感染人退变椎间盘髓核细胞后对其细胞外基质代谢的影响。结果：感染复数（MOI）为60时可获较满意感染效率。Real-timeqPCR示目的基因感染组的TGFβ3、TIMP1、Ⅱ型胶原、蛋白多糖mRNA表达量均明显高于空病毒感染组及空白对照组（F＝16.35

3、0～74.378，q=2.010～10.620,P<0.05），而空病毒感染组和空白对照组间无统计学差异。Westernblot示目的基因感染组的Ⅱ型胶原、蛋白多糖蛋白表达量均明显高于空病毒感染组和空白对照组（F＝50.495～66.110，q=8.061～16.624，P<0.05），而空病毒感染组和空白对照组间无统计学差异。结论：慢病毒载体介导的TGFβ3和TIMP1双基因联合感染人椎间盘髓核细胞可长时间稳定表达，发挥生物学效应，促进蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成，并最终改善髓核细胞外基质的代谢。硕士研究生邱晨生（骨科学）指导教师陈伯华教授关键词：转化

4、生长因子β3；基质金属蛋白酶抑制剂1；慢病毒属；椎间盘退变BIOLOGICALEFFECTSOFLENTIVIRAL-MEDIATEDTGFβ3ANDTIMP1CO-INFECTIONONHUMANNUCLEUSPULPOSUSCELLSINVITROCULCUREAbstractObjective:Tostudytheeffectsoflentivirus-mediatedTGFβ3andTIMP1co-infectiononhumandegenerativenucleuspulposuscellsinvitrocultureinordertosl

5、owdownorreversethedegenerationofintervertebraldisc.Methods:Humandegenerativenucleuspulposus(NP)cellsacquiredfromsurgicalpatientswereculturedbymonolayerculture.EvaluatetheinfectionefficiencyofNPcellsinfectedbylentiviruswithgreenfluorescenceprotein(GFP)gene.ThelentiviruscarryingT

6、GFβ3andTIMP1weretransducedintohumandegenerativeNPcells,andthechangesofextracelluarmatrixofNPcellsweredetectedbycellmorphology,Real-timeqPCRandWesternblot.Results:Satisfiedinfectionefficiencywasobtainedwhenmultiplicitiesofinfection(MOI)was60.TheexpressionsofTGFβ3,TIMP1,CollagenⅡ

7、andAggrecanmRNAinpositivegroup(carryingtargetgenes)werehigherthanthoseincontrolgroups(F＝16.350～74.378，q=2.010～10.620,P<0.05).TheproteinlevelsofCollagenⅡandAggrecanwereelevatedsignificantlyaftertransfectioncomparedwiththecontrolgroups(F＝50.495～66.110，q=8.061～16.624，P<0.05).Concl

8、usion:CombinedLenti-TGFβ3-P2A-TIMP1canlastforalongperi