退变人髓核细胞体外培养及对tgf—β1和igf1干预的反应性研究

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1、y’9‘3lS8HumandegeneratiVeNucleusPulposuscellcultureinVitro：InVestigationoftheResponsibilitytotissuegrowthfactor．B1andinsulin—IikegrOwthfactor_1ADissertationSubmittcdtoSoutheastUniVersi母FortheAcademicDegreeofMedicineBYWANGLeiSupervisedbyProfessorWUXiao。taoSchoolofclinicalmedicineSoutheastU

2、niverSit)rMav2005摘要中文摘要背景介绍：下腰痛发病率较高，并造成巨大的社会经济损失，大约有75％到80％的人一生中发生过下腰痛，椎间盘退变(DDD)是其主要原因。现在的治疗方法有保守治疗和手术治疗，主要针对的是患者的临床症状，而不是针对疾病的病理过程。随着分子生物学技术的发展，在细胞水平治疗DDD有望成为现实。DDD的病因学和病理生理学尚不十分清楚。己知正常髓核中富含蛋白多糖和II型胶原，纤维环富含I型胶原。早期DDD由髓核中蛋白多糖减少引起。在生物化学水平，蟹白多糖减少反应了髓核细胞合成和分解代谢的失衡．随着基质中蛋白多糖减少，髓核脱水、高度降低使椎问需

3、：承载能力下降，从而影响脊柱的生物力学性能。虽然DDD包含了很多生物化学和生物力学因素．但通过治疗米增加蛋白多糖含量．从而增加其含水量及生物力学性能是有潜在治疗效果的。1991年Thompson等发现胰岛素样生长因子(1GF-1)、表皮样生长因子(EGF)、转化生长网子一D(TGF-呻1)能使体外培养的犬椎间盘细胞增加蛋白多糖的合成，并提出用生长因子治疗DDD。实验目的：(I)经皮穿刺抽吸术诱发兔椎间盘变性，验证椎问盘结构缺失导致椎间盘退变的理论。(2)找出分离退变髓核细胞的简单易行的办法(3)观察在体外培养条件F，退变髓核细胞的生艮情况。(4)观察’rGF—B1和IGF

4、～1对髓核细胞的生物学活性影响方法：本实验首先将兔椎间盘进行穿刺抽吸使其变性，2周后采用胰酶+胶原酶联合消化法分离该椎间捅的髓核细胞，分离所获细胞用DMEM／F12混合培养基进行单层培养。台盼蓝染色测定活力，观察细胞倍增时间。人退变髓核细胞分离后同上述培养，台盼蓝染色测定活力，观察其生长状况，记录细胞数目倍增时间，用免疫组化和考马斯亮蓝测定法观察细胞在生长因子干预下合成II型胶原能力的改变。结果：兔变性髓核细胞和正常髓核细胞倍增时间相同，髓核细胞体外传代后活力下降。人髓核细胞台盼蓝染色测定活力在90％～95％，传代后活力减弱。加入TGF—B1和IGF—l干预，细胞合成II

5、型胶原含量增加，联合使用效果更加明显。TGF—Bl和IGF—l干预细胞活性具有时间依赖性。结论：(1)经皮穿刺抽吸术可以造成兔椎间盘变性，验证了椎间盘结构缺失导致椎间盘退变的理论(2)胰酶+胶原酶联合消化法，能够在短时间内得到高活率细胞，胶原酶的联合使用，可以更好的解释退变椎间盘组织中胶原成分的改变。(3)证明一定浓度的TGF～B1和IGF～l在短期内能够部分改善退变的髓核细胞的生物学活性，两种药物合用效果更为显著，同时该两种药物对髓核细胞的作用呈时间依赖性一关键词：椎间盘退变髓核细胞细胞培养经皮的东南大学硕士学位论文AbstractBackground：Lowbackp

6、ainisoneof血emajorcausesofdisabilityand，thus，hasamajorsocioeconomicin巾act．ThelifetimepreValenceof】owbackpainis75％to80％ofthepopulation．ManyoftllesespinalimpaillIlentsaremedirectorindirectresultofdegenerativediscdiseaSe(DDD)．Currenttreatmemoptions，includingbothconservativeandsurgicaImeaSures

7、，targettheclinicalsymptomsofimervertebraIdiscdegeneration，asopposedtoaddressingthepamologicpmcessesoccurringearlyinmecourseofdegeneration．HoweveLrecentmolecularbiologytechnologydevel叩mentmayallowforthetreatmemsfocusingonthecellularchangesthatoccurinmisdisease．丁hepre