成人退变髓核细胞体外培养和细胞周期测定

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1、成人退变髓核细胞体外培养和细胞周期测定:邱匀峰，吴小涛，赵梓汝，王运涛【摘要】［目的］建立成人退变髓核细胞的单层培养模型并观察其形态；测定其细胞周期，探讨传代后髓核细胞生长不佳的原因。［方法］取24例椎间盘突出症患者手术切除的椎间盘组织，分离出髓核组织，胰酶和胶原酶消化，DMEM/12培养基培养。倒置相差显微镜观察其形态学特征，流式细胞分析仪检测原代和P2细胞周期。［结果］(1)原代髓核细胞生长良好，7d后贴壁生长的细胞可达90%o(2)原代细胞凋亡率为(38.10±11.7)%,P2代凋亡率为(44.74±17.6)%,原代S期细

2、胞(7.88±2.1)%,P2S期细胞(2.76±0・7)%。［结论］传代后的髓核细胞凋亡率增高，S期细胞减少明显。【关键词】椎间盘；髓核细胞；细胞周期；凋亡Abstract:［Objective］Toestablishaninvitrotensionalculturemodelofdegeneratednucleuspulposusanddetectsamples?cellcyclebyfloetrytostudyprotrudeddiscsof24patientsedium.Cellmorphologyicroscopeandc

3、ellcycleoftheprimaryandP2cellsetryafterproliferationinmonolayerculture・［Result］1.Primaryculturecellsofnucleuspulposusgreedium,and90%cellsadheretolayerafterabout7d・2.TherateofapoptosisofNP:primary(38.10+11.7)%,P2(44.74±17.6)%.TherateofSperiod:primary(7.88+2.1%),P2(2.76+

4、0.7)%.［Conclusion］EM/F12培养液的无菌培养瓶并置入冰盒内迅速带回实验室。半小吋内在超净台内剪碎消化培养，在无菌超净工作台中，将取出的髓核组织用PBS液冲洗3次去除血污，弃去纤维环，将胶冻样或软骨样髓核组织剪碎成1mmXlmmX1mm大小的碎块。37°C下以0.25%(m/v)的胰蛋白酶消化20min,每5min,轻轻摇动1次。800r/min离心5min,弃去上清液。36.5°C下用0.2%的II型胶原酶静置消化4h,至组织块逐渐消失。800r/min离心5min,去除上清液;用DMEM/F12培养液吹匀细胞，

5、再次离心，重复3次。用计数板进行细胞计数，按1X106接种于底面积为25cm2培养瓶中，加入5ml含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml和20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液。3丁C、体积分数为5%CO2的培养箱中培养。每2〜3d换液1次，每2d用倒置相差显微镜进行观察、拍照。90%融合后用质量分数为0.25%的胰酶消化并按1：2比例传代。1.2.2流式细胞分析细胞周期对原代髓核细胞和P2髓核细胞用流式细胞分析仪检测细胞周期及凋亡率。各组收集1X106个细胞，PBS洗涤，(缓慢加入3ml70%冷乙醇…20°C固定过

6、初。细胞检测前，PBS洗涤，加入碘化丙噪(PI)(sigma美国)1ml避光孵育20min。用流式细胞仪(美国BectonDickinson,FACSCalibur型)测定细胞周期，ModFit软件分析细胞周期的分布和凋亡率。每组样本重复3次。13统计学方法将所得数据以均数土标准差(x・土s)表示，并土对数据进行t检验(表1)。2结果2.1倒置相差显微镜观察髓核内有三类细胞：脊索细胞胞体较小，呈多角形，或圆形，胞浆内含空泡，贴壁后伸出伪足；软骨或类软骨细胞，胞体较大，呈圆形或椭圆形；成纤维样细胞，贴壁后呈梭形。2.2培养特性：原代培

7、养的退变髓核细胞的贴壁时间较长，24h后开始有少量细胞贴壁，3d后半量换液，7d后全量换液时可达90%贴壁(图1),甚至10d后仍有少量细胞贴壁。15〜20d后髓核细胞开始进入对数生长期，增殖、融合非常活跃，光镜下可见多处细胞克隆，并分泌大量颗粒，有较多细胞开始融合。原代培养30d达到90%融合可以传代(图2),传至第5d(P5)后的细胞体积增大，呈现圆形，或不规则形，片状生长，细胞增殖几乎停滞，同时胞内空泡增多，出现明显衰老迹象(图3)o图1贴壁后的髓核细胞呈多角形，圆形和梭形数量较少图2传代前的原代髓核细胞图3P3代的髓核细胞体

8、积明显变大，生长变缓，形态不规则。(X200)倒置像差显微镜观察表1原代及P2髓核细胞周期检测结果(n=24,x-±s)G0/G1SG2/M凋亡率原代(71.46±22.3)%(7.88±2.1)%(20.59±5.9)%(38.10