兔退变椎间盘模型中髓核细胞凋亡的实验研究

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1、兔退变椎间盘模型中髓核细胞凋亡的实验研究【关键词】椎间盘退变;退变模型;凋亡;激光共聚焦显微镜;兔　　[Abstract]Objective:Tostudytheeffectofnucleuspulposuscellsapoptosisontherabbitintevertebraldiscmodel.Methods:Rabbitmodelsofdegeneratedintevertebraldiscicroscopearkedapoptosisofnucleuspulposuscells;andRTPCRalgroup,theamountsofnucleuspulposusc

2、ellsalgroup.Conclusion:Theapoptosisinthedegeneratedintervertebraldiscmodelsexistsandplaysanimportantrole.　　[Keyodel;apoptosis;laserconfocalscanningmicroscope;rabbits　　腰椎退变性疾病是临床引起腰腿痛的主要病因，但椎间盘退变的病理机制目前并未完全清楚，年纪的增长、血管难长入、终板的病变导致椎间盘缺少营养、细胞的凋亡、胶原的变化、椎间盘机械负荷及蛋白多糖的变化等都被认为是导致椎间盘退变的病因。研究认为髓核细胞凋亡参与退变

3、过程并在此过程中起关键作用[1]。本实验通过针刺法制作兔退变椎间盘模型，通过模型研究椎间盘退变中凋亡的发生与发展规律。1材料和方法　　1.1材料　　新西兰大白兔(南京农业科学院种兔厂);激光共聚焦显微镜(LeicaTCSSP5，德国)，7.0TmicroMRI(Bruker公司，德国);恒温箱冷冻切片机(MICIROM325，德国);TaKaRaLAPCRTMKitVer.2.1试剂盒(大连宝生物工程有限公司);Trozol(Invitrogen公司，美国);红色荧光标记的TUNEL法凋亡检测试剂盒(InSituCellDeathTMRred，roche，瑞士);Bax和Bcl

4、2引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：Bax(225bp)上游为5′CCGTGACCATCTTTGTGGC3′，下游为5′TGTCCCGAAGGAGGTTTATT3′;Bcl2(452bp)上游为5′GGGAGAACAGGGTACGATAA3′，下游为5′CCACCGAACTCAAAGAAGG3′;βactin(155bp)上游为5′TATGACTTAGTTGCGTTACACC3′，下游为5′CCTTCACCGTTCCAGTTT3′。　　1.2方法　　1.2.1兔腰椎间盘退变模型的构建纯种成年新西兰大白兔32只，雌雄不限，平均质量2.5kg，

5、采用随机排列数方法分为正常组和退变组各16只，退变组采用侧方倒八字入路对L4-5节段椎间盘行针刺法造模[2]，术中暴露相应节段椎间盘后于椎间盘前方和左右侧方各用21号针头等深针刺5次(图1)，逐层缝合切口后继续饲养。　　图1手术路径(左图暴露椎间盘视野，右图为针刺法造模)　　Fig1Operativeapproach(Left.Exposureofthevisualfield;Right.Methodofacupuncture)　　1.2.2MRI检测造模后第8周耳缘静脉注射空气处死两组兔后取出相应节段脊柱，采用7.0TmicroMRI检测鉴定退变模型。水平扫描架内径16cm，

6、采用61mm大鼠体部射频线圈。脊柱标本取出后置于扫描架内。扫描序列采用TurboRACET22000EX透射电镜(JEOL公司，美国)下观察。　　1.2.4冰冻切片制作造模手术后第8周抽取两组新西兰大白兔，耳缘静脉注射空气10ml致死，迅速取相应节段椎间盘，标本离体后立即行O.C.T.包埋，置于液氮罐(-190℃)中冰冻保存，用恒温箱冷冻切片机制作6μm冰冻切片。每个椎间盘标本分别取不同层次3张切片。　　1.2.5HE染色计数髓核细胞冰冻切片制作成功后，常规固定，吹干后行HE染色，光镜下计数髓核细胞，每个切片计数2个视野。　　1.2.6激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡比率按原位细胞凋

7、亡检测试剂盒说明书步骤，切片于冰上经渗透液(0.1%TritonX100)孵育2min后，在黑暗的湿盒中用染色混合液37℃孵育1h，DAPI染色液孵育5min，期间常规漂洗，行抗荧光淬灭剂处理后封片。阳性对照用凋亡诱导剂(核酸酶)处理，阴性对照不加末端脱氧核糖核酸转移酶。采用激光共聚焦显微镜进行观察荧光染色的切片并行定量分析，每张切片在200×视野下找5个视野观测。激光共聚焦显微镜观测时波长设置如下：观察DAPI核染细胞激发波长405nm，发射波长454nm;观察TUNEL阳性