慢病毒介导MMP3-siRNA和Sox9转染兔退变髓核细胞的体内实验研究

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1、分类号：R392.2密级：公开学校代码：11065学号：2015021328专业硕士学位论文慢病毒介导MMP3-siRNA和Sox9转染兔退变髓核细胞的体内实验研究作者姓名李思源指导教师西永明教授专业领域外科学（骨外）培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月19日慢病毒介导MMP3-siRNA和Sox9转染兔退变髓核细胞的体内实验研究摘要目的：构建兔椎间盘退变的动物模型，利用慢病毒（lentivirusvector,LV）介导MMP3-siRNA和Sox9双基因体内转染兔退变髓核细胞，探讨单基因及双基因联合转染兔退变髓核细胞的生物学效应。方法：1.4月龄新西兰大白兔使用

2、针刺纤维环法构建兔椎间盘退变实验动物模型，手术后4周、8周行核磁共振检查及病理学检测，观察目的椎间盘的退变情况，及目的椎间盘造模成功情况。2.30只建模成功的新西兰大白兔随机分为6组，分别为①空白对照组，②PBS对照组，③空病毒组，④MMP3组，⑤Sox9组，⑥双基因组（MMP3-siRNA+Sox9），分别于造模的椎间盘髓核用微量注射器注入20μL：PBS磷酸盐缓冲液、rLVX-mCMV-mcherry、rLVX-CMV-hMMP3-shRNA-mCMV-mcherry、rLVX-CMV-hSox9-mCMV-mcherry、rLVX-CMV-hMMP3-shRNA-mCM

3、V-mcherry+rLVX-CMV-hSox9-mCMV-mcherry。于注射后8、12、24周行MRI检查观察椎间盘退变情况。术后24周空气栓塞法处死实验动物，取出目的椎间盘组织，行Western-Blot检查II型胶原、蛋白多糖水平的表达,行RT-PCR检查MMP3mRNA和Sox9mRNA表达水平。结果：1.手术成功后4周、8周对实验动物行腰椎MRI检查，获得其核磁共振的T2WI像。第8周手术组椎间盘的MRI的T2WI像信号开始减弱，病理学检测结果示椎间盘呈退变改变，提示造模成功。2.将目的基因转染到实验动物体内后8、12、24周行磁共振检查：空白对照组、PBS组、

4、空病毒组退变椎间盘MRI的T2WI像信号强度明显低于MMP3、Sox9和双基因组。空白对照组、PBS组、空病毒组两两比较MRI的T2WI像信号强度比较无统计学意义（P>0.05）；MMP3组、Sox9组MRI的T2WI像信号强度比较无统计学意义（P>0.05）；MMP3组、Sox9组与双基因组MRI的T2WI像分别比较显示具有统计学意义（P<0.05）。术后第24周，Western-Blot检查各组II型胶原、蛋白多糖表达，其中MMP3组、Sox9组和双基因组的II型胶原表达量有不同程度提高，双基因组II型胶原的表达均高于其他各组（P<0.05）。MMP3组和双基因组蛋白多糖

5、的表达高于其他组（P<0.05），Sox9组与PBS组、空病毒组比较，蛋白多糖表达未见明显升高（P>0.05），双基因组II型胶原的表达均高于其他各组（P<0.05）；RT-PCR检查各组MMP3、Sox9mRNA的表达情况，其中MMP3组、双基因组与PBS组、空病毒组、Sox9组比较MMP3mRNA表达水平明显降低（P<0.05），其中双基因组MMP3mRNA的表达水平均低于其他各组（P<0.05）。Sox9组和双基因组与PBS组、空病毒组及MMP3组比I较Sox9mRNA的表达水平明显升高（P<0.05），其中双基因组Sox9mRNA的表达水平均高于其他各组（P<0.05

6、）。结论：1.针刺纤维环法构建兔退变椎间盘实验动物模型方法成功有效，术后8周实验动物椎间盘影像学及病理学检查均显示造模成功。2.慢病毒介导MMP3-siRNA和Sox9双基因体内转染对兔退变髓核细胞有明显的延缓椎间盘退变的作用，明显的促进了退变椎间盘细胞外基质中II型胶原，MMP3-siRNA基因的转染促进蛋白多糖的表达，Sox9基因过表达不会促进蛋白多糖的表达。研究生：李思源（骨外科）指导老师：西永明教授关键词:椎间盘退变；慢病毒；MMP3基因；Sox9基因；基因治疗IIInvivoexperimentalstudyoflentiviralmediatedMMP3-siRN

7、AandSox9transferdegenerationnucleuspulposusinrabbitsAbstractObjective:TodevelopananimalmodelofintervertebraldiscdegenerationanduseMMP3-siRNAandSox9LentiviralVector(LV)totranfectandexplorethebiologicaleffectsofsinglegeneanddoublegenestransfectionofrabbitd