腺相关病毒介导的htgfβ1和htgfβ3双基因联合体内转染逆转兔退变椎间盘的生物学效应

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1、专量大学硕士学位论文腺相关病毒介导的hTGF01和hTGFl33双基因联合体内转染逆转兔退变椎问盘的生物学效应指导教师学科专业名称硷盎提五日期玲盎答辩目期譬辩毒自含主席刘海飞胡有谷教授王德春副教授外科学(目外科张光铂教授中文摘要腺相关病毒rAAV2介导的hTGFB1和hTGFl33双基因联合体内转染逆转兔退变椎间盘的生物学效应青岛大学医学院骨科研究生：刘海飞导师：胡有谷王德春摘要目的：制造兔椎间盘退变模型；应用腺相关病毒(adeno．associatedvirus，AAV)介导人转化生长因子131(humantransforminggrowthfactor-

2、D1，hTGF-131)、hTGF-B3基因体内转染兔退变椎间盘，观察目的基因的表达以及单基因转染或双基因联合转染对退变髓核细胞的生物学作用。方法：成年新西兰大白兔通过注射纤维结合素片段(fibronectinfragment，Fn-f)制造椎间盘退变模型，造模后2、4、8、12周分别进行影像学、形态学、组织学检测，观察造模椎间盘变化。将造模成功动物随机分为4组，各组分别于造模髓核内注射rAAV2．hTGF131、rAAV2一hTGF133、rAAV2．hTGF131+rAAV2-hTGFB3、rAAV2一EGFP(enhancedgreenfluoresc

3、entprotein，EGFP)，自身对照组椎间盘内注射磷酸盐缓冲液PBS。手术后4、8、12周时，收获各组髓核组织作组织培养或裂解，蛋白多糖的合成由35s硫酸盐结合率来测定，免疫印迹Western．Blot法检测髓核II型胶原的含量。分别于术后1周、12周观察hTGF-B1和EGFP的表达。结果：(1)退变椎问盘内注射rAAV2．hTGFl311周后，髓核中hTGF—B1含量较注射PBS椎间盘显著增多；注射rAAV2一EGFP椎间盘，术后12周仍可观察到EGFP的表达。(2)基因转染后4周、8周、12周，转染rAAV2．hTGFl31组、rAAV2一hTG

4、F133组和双基因联合转染组髓核组织II型胶原和蛋白多糖的表达均较自身PBS组增高，各组均有显著差异。转染rAAV2．EGFP组同自身对照PBS组比较没有显著差异；(3)造模后4、8、12周，双基因联合转染组椎间盘II型胶原和蛋白多糖的表达高于单基因转染椎间盘，有显著差异。结论：rAAV2介导的hTGFl31和hTGFl33转染退变的椎间盘髓核细胞后，hTGFp1和hTGFl33可持续表达12周，并可有效的促进退交椎间盘蛋白多糖和II型胶原的合成；双基因联合转染具有协同效应。关键词：腺相关病毒；转化生长因子13；转染；基因治疗注：本课题受国家自然科学基金项目

5、支持(项目批准号：30271318；分类号：C03030306)英文摘要S’I'UDYOFADENOASSOCL钔n￡DVⅡUJS．M【EDIArEDCOTRANSIrEROFhTGF．BlANDhTGF·B3ENCODINGGENESTOTBOEDEGENERATIVENUCLEUSPULPOSUSCELLSOFRABBllrS：11r’SBIoLOGJo扎EFFECTSONMAlWXREPAmINⅥVO．ABSTRACTObjectives：Adeno-associatedviruswasappliedtomediatehTGF-BIandhTGF-B3

6、encodinggenestothedegenerativenucleuspulposuscellsofrabbits·theexpressionandbiologicaleffectsonmatrixrepairoftherapeuticgeneswereassessed．Methods：RabbitmodelsofdiscdegenerationwereestabolishedbyinjectingtheN—terminal30-kDafibronectinfragment(Fn-0，4weekslater,salinewithorwithoutvims

7、wasinjecteddirectlyinto112lumbardiscsof28skeletallymatureNewZealandwhiterabbits．Group1(n=8)receivedtherAAV2一hTGFBIorPBSonly(self-contr01)；Group2(n=6)receivedadeno·associatedviruscontaininghTGFB3geneorsalineonly(self-contr01)；Group3(n=6)recivedrAAV2一hTGFBlandrAAV2-hTGFB3，PBSselvesas

8、self-control；Group4(n=8)re