西罗莫司对肝癌hepg2细胞中hif

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1、西罗莫司对肝癌HepG2细胞中HIF【摘要】目的研究西罗莫司对氯化钴（CoCl2）诱导的肝癌HepG2细胞中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的影响。方法用CoCl2诱导细胞模拟缺氧微环境，并根据CoCl2浓度不同分为0、50、100、200及400μmol/L组；选择CoCl2浓度为200μmol/L来模拟肿瘤内缺氧微环境，同时分别联合0、10、20、30、40nmol/L的西罗莫司作用于细胞24h。应用逆转录-聚合酶链反应检测HIF-1αmRNA的表达。结果随CoCl2浓度提高，HIF-1αmRNA的表达升高（F=103.67,q=4.83～24.15,P

2、<0.05），其中CoCl2浓度为200和400μmol/L两组比较差异无显著性（q=0.69,P>0.05）；西罗莫司可使HepG2细胞HIF-1αmRNA的表达降低并呈剂量依赖性（F=127.90,q=4.24～28.28,P<0.05）。结论缺氧微环境可以促进HepG2细胞中HIF-1αmRNA的表达，HIF-1α可能通过在细胞缺氧调控中起作用而参与了肿瘤的发生发展。西罗莫司可以抑制HIF-1αmRNA的表达，这可能是其抗肿瘤的机制之一。【关键词】肝肿瘤；HepG2细胞；西罗莫司；缺氧诱导因子1，α亚基　　［ABSTRACT］Objecti

3、veToinvestigatetheeffectofsirolimusontheexpressionofhypoxia-induciblefactor-1alpha（HIF-1α）inhumanhepatocellularcarcinomaHepG2cellsinducedbycobaltchloride.MethodsCobaltchlorideimicthecellhypoxicmicroenvironment,andHepG2cellsol/Lgroups.Theconcentrationof200μmol/Lofcobaltchlorideimictumo

4、rhypoxicmicroenvironment,and,atthesametime,differentconcentrationsofsirolimus（0,10,20,30,and40nmol/L）RNAi-quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR）.ResultsI1640培养基为美国Gibco公司产品；胎牛血清为美国Gibco公司产品；SRL为Sigma公司产品；Trizol试剂盒购自Introvigen公司；RT-PCR试剂盒购自美国Promege公司；引物及GAPDH

5、内参由上海生工生物工程公司提供。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养　　人肝癌HepG2细胞由南京凯基生物科技有限公司提供。将肝癌HepG2细胞接种于含体积分数为0.10的胎牛血清的1640培养基,内含100U/L青链霉素，在37℃、体积分数为0.05的CO2、正常氧浓度与饱和湿度的培养箱中培养，进入对数生长期后，传代于6孔细胞培养板中，选择生长良好的肝癌细胞用于实验。　　1.2.2实验分组　　对照组用培养液培养48h，实验组用培养液培养24h后，用含不同浓度CoCl2的培养液处理细胞24h，根据CoCl2浓度不同分为5个亚组（0、50、100、200和400μm

6、ol/L组）；选择CoCl2浓度为200μmol/L来模拟肿瘤内缺氧微环境，用培养液培养细胞24h后，对照组用200μmol/L的CoCl2培养液培养24h，实验组用含SRL分别为0、10、20、30、40nmol/L的200μmol/L的CoCl2培养液培养24h。　　1.2.3RT-PCR　　TRIZOL法提取6孔板内各组细胞的总RNA，紫外线分光光度计测定总RNA浓度，重复测定3次，-70℃冰箱保存。各样本取1μg总RNA，按Promege一步法使用说明书进行RT-PCR；所用引物由上海生物工程技术有限公司合成：HIF-1α上游引物序列为5′-ACGTGTT

7、ATCTGTCGCTTTG-3′,下游引物序列为5′-TAGGTTTCTGCTGCCTTGTAT-3′,目的片段长度为371bp；内参照基因GAPDH的上游引物序列为5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物序列为5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，目的片段长度为146bp。RT-PCR反应条件：45℃逆转录45min，94℃预变性2min，94℃变性30s，64℃退火1min，68℃延伸2min，27次循环后68℃终末延伸7min。取出5μLPCR产物，加1μLLoadingbuffer，反复吸打混匀后，于20g/L的

8、琼脂糖凝胶