低氧对肝癌hepg2细胞hif-1α、vegf、bcl-2、bax蛋白表达与增殖能力的影响

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1、万方数据朱以佳低氧对肝癌HepG2细胞HIF．1ct、VEGF、Bcl一2、Bax蛋白表达及增殖能力的影响·9·殖能力的改变，通过WB法检测不同程度低氧对HepG2细胞中HIF—la、VEGF、Bcl一2、Bax蛋白表达的情况，并分析这四种蛋白在肝癌生长和转移过程中的作用，为指导临床治疗和判断患者预后提供可靠的依据。万方数据扬州大学硕士学位论文材料与方法1．实验材料1．1材料与仪器1．1．1细胞系人肝癌HepG2细胞系购自上海艾研生物科技有限公司1．1．2耗材与试剂DMEM细胞培养基美国Hyclone生物科技有限公司胎牛血清浙江天杭生物科技有限公司胰蛋白酶美国Sigma

2、生物科技有限公司青霉素、链霉素购白扬州市第一人民医院CoCl2美国Sigma生物科技有限公司DMSO美国Sigma生物科技有限公司TEMED美国Sigma生物科技有限公司CCK一8试剂盒武汉博上德公司BCA蛋白浓度测定试剂盒上海碧云天生物技术有限公司ECL发光试剂盒上海碧云天生物技术有限公司RIPA裂解液上海碧云天生物技术有限公司PMSF上海碧云天生物技术有限公司PVDF膜上海碧云天生物技术有限公司柯达医用X射线胶片厦门Kodak公司5×SDS．PAGE蛋白卜样缓冲液上海碧云天生物技术有限公司兔抗人HIF．113,单克隆抗体美国SantaCruz公司鼠抗人VEGF单克隆

3、抗体美国SantaCruz公司鼠抗人Bcl．2单克隆抗体美国SantaCruz公司鼠抗人Bax单克隆抗体美国SantaCruz公司鼠抗人GAPDH单克隆抗体美国SantaCruz公司?仁抗兔IgG／HRP美国SantaCruz公司羊抗鼠IgG／HRP美国SantaCruz公司细胞冻存管美围Coming公司加样枪德国Eppendorf公司万方数据朱以佳低氧对肝癌HepG2细胞HIF-la、VEGF、Bcl．2、Bax蛋白表达及增殖能力的影响-11-无酶离心管无酶Tip头无酶EP管6孔板、96孔板细胞培养瓶1．1．3主要仪器细胞培养箱电子天平光学倒置显微镜超净工作台普通冰箱

4、一80℃冰箱低温高速离心机普通离心机酶标仪脱色摇床磁力搅拌器电泳槽高压蒸汽灭菌器细胞计数板1．2相关实验试剂配制美国Coming公司上海碧云天生物技术有限公司美国Coming公司美国Thermo公司3111上海精密仪器有限公司口本Olympus苏州净化中国海尔电子有限公司同本SANYO电子有限公司美国Sigma公司3K30湖南湘依仪器有限公司美国Bio．Rad公司680江苏正基仪器公司上海沪两仪器公司美国Bio．Rad公司164—5051上海博迅医疗设备厂上海医用制品厂1．2．1培养基的配制首先将配制培养基的器皿清洗干净，将DMEM粉末13．59溶于300ml水中，冲洗

5、培养基包装袋内面用水冲洗，保证所有粉未溶解，加入HEPES2．389，NaHC033．79，搅拌直至全部溶解。调节口H至7．5，并定容垒1L。然后在超净台内使用滤器过滤，之后放入2—8℃冰箱内避光保存。此外，分别取过滤前后10ml培养基于37。C培养箱培养24h，检测是否无菌。使用前加入双抗(青霉素100U／ml，链霉素10099／m1)和胎牛血清(10％)。1．2．2不同浓度CoCI。溶液的配制将23．8mgCoCl2晶体溶解于lOml超纯水中，配制出浓度为10mmol／L的CoCl2母液。将母液在超净台用滤器过滤。实验时，每lml细胞培养液中加入5“1、lOlal、

6、20I_tl、309l、万方数据扬州人学颂+学位论文。12·一——————————————————————————————————————————————————————————————————————————一50}．tl的CoCl2母液，即可得到COCl2终浓度分别为50pmol／L、1001-tmol／L、200肚mol／L、300pmol／L、500I_tmol／L的培养液。1．2．312％SDS-PAGE分离胶(20mI)蒸馏水30％Acr—Bis(29：1)1MTris—HCI10％SDS10％过硫酸铵TEMED1．2．45％SDS-PAGE浓缩胶(10m1

7、)蒸馏水30％Acr—Bis(29：1)lMTris．HCl10％SDS10％过硫酸铵TEMED1．2．5电泳转移缓冲液(1L)"Iris—Base甘氨酸甲醇蒸馏水1．2．6封闭液l×TBS脱脂奶粉Tween200．05％PBST1．2．7TBST1XTBSTween202．实验方法6．6m18．0ml5．0ml0．2ml0．008ml6．8ml1．7ml1．25mlO．1ml0．1ml0．01ml3．03914．429200ml加至1L50ml2．590．5m1100m11000mllml万方数据朱以住低氧对肝癌HepG2细胞HIF．1