sirnaid1对人肝癌细胞hepg2中er

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1、siRNAID1对人肝癌细胞HepG2中ER【摘要】目的观察siRNAID1转染人肝癌细胞HepG2细胞后对肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响及其对ERK1/2通路的作用。方法实验分为4组，即空白对照组、转染试剂组、转染对照组及转染siRNAID1组。阳离子脂质体法介导siID1转染肝癌细胞后，唑蓝比色法(MTT)观察HepG2细胞增殖情况。分别用反转录聚合酶链式反应法(RTPCR)和蛋白免疫印迹法(AP激酶类;肝肿瘤;转染;信号传导;氮蓝四唑;RNA，小分子干扰近期发现，丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedprot

2、einkinase,MAPK)信号途径的激活可能是DNA结合抑制因子1(inhibitorofdifferentiation/DNAbinding1,IDl)诱导细胞增殖的一个机制[1]。与正常组织相比较，肝癌组织中的MAPK通路上的细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinase,ERK)都是处于高表达及高活性状态。若使用其ERK抑制剂就可以减缓细胞的增殖及引起细胞的凋亡[2]。本研究通过小分子干扰RNA技术使ID1基因沉默，观察其对HepG2细胞增殖的影响及其对ERK1/2mRNA及蛋白表达的影响

3、，探讨ERK1/2及其信号转导途径与肝癌发生发展的关系。　　1材料和方法　　1.1材料人肝癌细胞株HepG2细胞(上海科学院细胞中心);siRNA试剂(广州锐博生物有限公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT，厦门泰京生物有限公司);逆转录聚合酶链反应(RTPCR)试剂盒(美国Fermentas公司);PCR引物由上海鼎安生物科技有限公司合成;兔抗人ERK1/2多克隆抗体，兔抗人pERK1/2多克隆抗体，辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(美国SantaCruz公司)。　　1.2分组分为4组，即空白对照组(正常培养HepG2细胞组);转染试剂组(

4、即仅加入Lipofectamine2000组;转染对照组(即转染非特异性序列controlsiRNA组);转染siRNAID1组。　　1.3方法　　1.3.1siRNA的设计和合成siRNAID1由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。　　靶序列：5’TGAGCAAGGTGGAGATTCT3’　　正义链：5’UGAGCAAGGUGGAGAUUCUdTdT3’　　反义链：3’dTdTACUCGUUCCACCUCUAAGA5’　　1.3.2细胞的培养与转染细胞常规培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基，于37℃、体积分

5、数为0.05的CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(无抗生素)将消化后的HepG2细胞制备成细胞悬液;调整细胞浓度为1×107L-1，接种于细胞培养板内(6孔加入2mL，每孔2×104细胞)，培养24h。参照说明书建议，将siRNA浓度稀释为50nmmol/L，阳离子脂质体法介导siRNAID1转染肝癌细胞。存放24h后备检测。　　1.3.3MTT法测定细胞增殖将对数生长期细胞接种于96孔板，每组设4个复孔，分别于培养24，48，72，96h后;每孔加入20μLMTT(5g/L)，继续培养4h。弃去上清

6、，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150μL，平板摇床震摇10min，酶联免疫检测仪测定490nm处的吸光度(OD值)。　　细胞增殖抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值　　1.3.4RTPCR检测ERK1/2及pERK1/2mRNA的表达水平用Trizol提取总RNA，反转录成cDNA。(1)内对照β肌动蛋白(βactin)，扩增片段556bp;循环条件：4℃预变性5min，扩增94℃30s→57℃30s→72℃45s，30个循环，最终延伸72℃7min。　　上游：5’AAAGACCTGTACGCCAACACAG3’　

7、　下游：5’TTTTAGGATGGCAAGGGACTTC3’　　(2)ERK1/2扩增片段320bp;循环条件：预变性5min，扩增94℃30s→59℃30s→72℃30s，30个循环，最终延伸72℃7min。　　上游：5’TACACGCAGTTGCAGTACATCG3’　　下游：5’CGCAGGATCTGGTAGAGGAAGT3’　　(3)pERK1/2扩增片段248bp;循环条件：94℃预变性5min，扩增94℃30s→55℃30s→72℃30s，30个循环，最终延伸72℃7min。　　上游：5’GGAGCTTGTGGAAATAC

8、CTTGG3’　　下游：5’GACGCAGTGTTCCTCTCTGCTA3’　　PCR扩增产物用凝胶图