sirna沉默cip2a基因对人类肝癌细胞hepg2增殖影响

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityfortheDegreeofMasterTheProliferationEffectsofsiRNASilencingofTheCIP2AGeneOnHumanHepG2CellByJunLinChenSupervisor：Prof．JianyingZhangEpidemiologyandHealthStatistics一一一ColleageofPublicHealthJune，2012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文

2、中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明．本声明的法律责任由本人承担．学位论文作者(签名)：豚趋袄2012年6月5日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。

3、本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定．学位论文作者(签名)：陈1恕k2012年6月5日㈣加删7M2舢0删—●洲2舢Y本课题受以下项目基金资助：国家自然科学基金面上项目(GeneralProgramofNationalNaturalScienceFoundationofChina)【项目编号：30872962】摘要目的CIP2A是蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子。用RNA干扰技术使人肝癌细胞HepG2细胞中的CIP2A基因沉默不表达。设计出了五个CIP2A基因的干扰片段

4、，另外设计一个不含干扰片段的plko-control组，从中筛选出一个沉默效率最佳的干扰片段。将筛选出的最佳干扰片段稳定转染入HepG2细胞中并用嘌呤霉素筛选以获得稳定表达细胞株。利用Westernblot、RT-PCR和MTT等实验方法以探索CIP2A基因对人肝癌细胞HepG2细胞的生物学效应以及与CIP2A基因与c-Myc基因的相互关系。方法l将带干扰片段的质粒转化入感受态细胞大肠杆菌DH5a，提取质粒，通过双酶切鉴定和测序确定干扰片段的正确性。2将带干扰片段的质粒用Lipofectamine2000转染入人肝癌细胞HepG2细胞中，用Wester

5、nblot和RT-PCR技术从五条干扰片段中筛选出一条沉默CIP2A基因最佳的序列。3确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度：确定出嘌呤霉素用于筛选稳定表达细胞株的最佳浓度。4获得稳定表达的细胞株：将能沉默CIP2A基因的最佳干扰质粒稳定转染入人肝癌细胞HepG2细胞中，用嘌呤霉素筛选以获得稳定表达细胞株。5CIP2A基因沉默后对c—Myc基因的影响：用Westemblot和RT-PCR检测CIP2A基因沉默之后c．Myc蛋白的表达情况和c．MycmRNA的表达情况。6CIP2A基因沉默后对人肝癌细胞HepG2细胞的生物学影响：用MTT法检测CIP2A基因沉默之后

6、对人肝癌细胞HepG2细胞生长情况的影响。结果质粒转化大肠杆菌之后所提质粒经酶切鉴定和测序鉴定后均为带目的干扰片段的质粒。瞬时转染之后检测瞬时转染细胞中CIP2A蛋白和mRNA的表达情况，得到沉默CIP2A基因最佳的序列为plko．1．2。将plko．1．2转染入HepG2细胞用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株，RT-PCR结果显示：plko．1-2组中CIP2A基因的mRNA的表达分别与空白对照组和plko．1-control组相比差异均有统计学l。摘要意义(P<0．01)且显著降低：plko．1·2组中c-Myc基因mRNA的表达分别与空白对照组和p

7、lko．1-control组相比差异均无统计学意义(舢．05)。Westernblot检测结果显示：plko．1．2组中CIP2A蛋白的表达分别与空白对照组和plko．1-c．ontrol组相比差异均有统计学意义(P《0．01)且显著降低；plko．1-2组中coMyc蛋白的表达分别与空白对照组和plko．1-control组相比差异均有统计学意义(p，o．01)且显著降低；MTT检测结果显示：siRNA沉默CIP2A基因之后，细胞的增殖能力减弱。结论将带干扰片段的质粒转化入感受态细胞大肠杆菌DH5a，提取质粒，通过双酶切鉴定和测序确定干扰片段的正确性

8、。最佳沉默效率的质粒为plko．I．2，将其稳定转染入HepG2细胞中，结果显示：CIP2A基