端粒酶抑制剂作用人鼻咽癌细胞株cne2后蛋白表达谱的变化

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1、端粒酶抑制剂作用人鼻咽癌细胞株CNE2后蛋白表达谱的变容敏华(广西医科大学肿瘤医学院广西南宁530021)【摘要】目的分析不同作用机制端粒酶抑制剂分别作用于CNE2鼻咽癌细胞株后蛋白表达谱的变化。方法用EGCG等八种不同的端粒酶抑制剂分别作用于CNE2细胞，提取药物作用后细胞的总蛋白，运用基层辅助激光解析时间飞行质谱技术检测蛋內的变化，筛选共同差异蛋內。结果CNE2细胞经八种端粒酶抑制剂作用后，分别有14,26，27,23，31，42,26,30个蛋0低表达；分别有22,11,18，18,7,7,1

2、3,8个蛋白质高表达；均呈低表达的差异蛋白1个，相对分子量为2657.14Da,无共同高表达的差异蛋白。结论八种端粒酶抑制剂作用后，CNE2细胞表现出共性变化的蛋0。这些蛋白可能参与端粒酶活性的调控，可能是不同机制端粒酶抑制剂作用的共同靶点。【关键词】端粒酶端粒酶抑制剂鼻咽癌细胞SELID-TOF-MS【屮图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2012)12-0394-02端粒酶(telomerase)是由RNA和蛋白质构成的一种特殊的DNA聚合酶，具有逆转泶酶活性。已

3、证实端粒酶在肿瘤发生、发展过程屮起着重要的作用，端粒酶已成为当今肿瘤新的标志物和肿瘤治疗的新靶点［1］。近年不同学者致力于开发不同作用机制的端粒酶抑制剂，不同作用机理的抑制剂在不同类型细胞的生物分子靶点不一，端粒酶活性可能存在某些调控机制，不同端粒酶抑制剂可能在这些调控通路上的不同环节起丫作用［2,3］。但目前端粒酶的关键调控机制尚不清晰［4］。表面増强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术是蛋白质组学屮一种很重要的新质谱技术，通过它可对比同一组织在不同生理状态K的蛋白质组谱图，

4、发现该组织蛋白质组屮各蛋白质表达量的变化。本研究以人鼻咽癌CNE2细胞为研究对象，将EGCG、AZT、ATRA、ADM、针对人端粒酶RNA(hTR)及其催化亚基(hTERT)的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸八种不同作用机制的端粒酶抑制剂分别作用于CNE2细胞，运用SELDI技术分析癌细胞前后表达的差异蛋白以及共性蛋白，从而探讨端粒酶活性的关键调控因素和可能作用机理。1材料与方法1.1细胞株：CNE2细胞株从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购买。在5%CO2,37°C条件下，培养于含10%胎牛血清

5、的RPMI-1640培养基中，常规换液及传代。1.2端粒酶抑制剂：针对hTR的核什酸序列ASODN5’CTCAGTTAGGGTTAGACAA3’，SODN：5’CTAACCCTAAC3’；针对hTERT的核苻酸序歹

6、J:HASODN5’GGAGCGCGCGGCATCGCGGG3’，HSODN5’CCCGCGATGCCGCGCGCTCC3’，EGCG(Epigallocatechingallate)、AZT

7、、ATRA、ADM,均购自Sigma公司；1.3ProteinChip®BiologySystem(PBSIIC)及其配套的CM-10芯片，美国CiphergrnBiosystems公司；1.4端粒酶抑制剂作用细胞：CNE2细胞状态良好且长满培养瓶底面积约60%时分别力门入ADM、AZT、ASODN、ATRA、EGCG、HASODN>HSODN和SODN8种端粒酶抑制剂，终浓度分别为lmg/L，20μmol/L,6μmol/L,10μmol/L,125mg/L,5μm

8、ol/L,5μmol/L,6μmol/L。48h后收集加药后细胞作为加药处理组，以及同代培养未加药物CNE2细胞作为对照组。1.5裂解细胞：倒弃培养液，用火菌的PBS(PH=7.4)5ml轻轻洗涤培养瓶底3次。加入预冷的细胞裂解液2〜3ml，置摇床，200rpm冰上振荡裂解30〜60min。将裂解后液体在4°C,12000rpm，离心5min后吸取上清液至3000Da的超滤离心管，12000rpm,4°C,离心30〜60min,浓缩体积至200〜300μl。Brandford法测浓

9、缩后裂解液蛋白浓度。1.6蛋白芯片裂解液样品的准备：分别取10μl样品裂解液至1.5mlEP管，按样品蛋白总质量：U9缓冲液体积为40:1的比例分别加入U9缓冲液稀释；冰浴振荡30min(400〜600rpm);将适量WCX-2buffer加入上述变性后样品，使样品终浓度为1.0μg/μl,尽快混匀。1.7芯片检测：芯片每孔加入2MNaCI200μl,室温下120rpm振20min,倒弃NaCI;加入去离子水200μl，室温下120rpm